1、1CRISPR/Cas9-based genome editing technologyA robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组()1. pYLCRISPR/Cas9 多靶点载体介绍CRISPR/Cas9 是新近发展的基因组编辑技术（图 1） 。CRISPR/Cas9 切割靶序列仅需要 single-guide RNA (sgRNA)以及由 sgRNA
2、引导的 Cas9 蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs） ，TALENs 更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。我们利用 CRISPR/Cas9 技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点 CRISPR/Cas9 基因打靶载体系统。本套载体将 Cas9 蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个 sgRNA 表达盒的多克隆位点 Bsa I 位于靠近双元载体 RB 位置。sgRNA 表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和 PCR 方法拼装好，再利用 Golden Gate 或 Gibson Assembly 克隆方法组装到双元载体上。Figure 1. A wo
3、rking model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB).22CRISPR/Cas9 载体与 sgRNA 载体图谱2.1CRISPR/Cas9 双元载体本套载体系统的双元载体骨架为 pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296)，Cas9p 为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有 5端 GC 含量较高的特征 (Figu
4、re 2)。这些质粒在 E. coli TOP10F(LacIq) 菌株繁殖，该菌株 LacIq 基因型产生的阻碍蛋白可抑制 ccdB 大肠杆菌致死基因的表达。pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B 载体中的 Cas9p 用 pUbi 驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子叶植物，目前优先使用 pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B。我们用 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H 在拟南芥也打靶成功，但与 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 对拟南芥的打靶效率比较正在测试中。我们对 pYLCRISPR/Cas9 载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表
5、 1。Figure 2. A CRISPR/Cas9 system for monocot and dicot plants.pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B (above); pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B (below); HPT (-H), Bar (-B), and NPT II (-N) encode hygromycin B phosphotransferase, PPT acetyltransferase and neomycin phosphotransferase II, respectively. NLS, nuclear local
6、ization sequence. The key sequences including restriction sites for cloning and analysis of sgRNA expression cassettes are given. Two Bsa I-cutting sties Bsa I (B-L) and Bsa I (B-R) for cloning the sgRNA expression cassettes are separated by a shorten form of the ccdB negative selection gene.3表一 pYL
7、CRISPR/Cas9 载体新旧命名对应关系新命名 原命名 适用植物种 植物抗性pYLCRISPR/Cas9Pubi-H pYLCRISPR/Cas9-MH,pYLCRISPR/Cas9-MTmono单子叶/双子叶 潮霉素pYLCRISPR/Cas9Pubi-B pYLCRISPR/Cas9-MB 单子叶/双子叶 草甘磷pYLCRISPR/Cas9P35S-H pYLCRISPR/Cas9-DH 双子叶 潮霉素pYLCRISPR/Cas9P35S-B pYLCRISPR/Cas9-DB 双子叶 草甘磷pYLCRISPR/Cas9P35S-N pYLCRISPR/Cas9-DN 双子叶 卡那霉素
8、2.2 CRISPR/sgRNA vectors sgRNA 序列全长 96 nt，分为两部分， 5决定靶序列的 20 碱基 (seed sequence)和 3区域为保守的结构序列。因此构建针对特定靶位点的 sgRNA，只需要克隆决定靶序列的 5端 20 nt (seed sequence)。 sgRNA用 small nuclear (sn) RNA U6/U3 启动子驱动，以保证转录出的 sgRNA 停留在细胞核中与 Cas9 结合。本方案用 PCR 扩增的方法构建包含靶序列的 sgRNA 表达盒，并在扩增引物 5端引入顺次排列的位置特异 Bsa I 酶切位点，用于 Golden Gat
9、e 克隆。或在扩增引物 5端加入互补序列用于 Gibson Assembly 连接克隆。为了提高构建好的多靶点载体的稳定性，避免在农杆菌或者植物基因组中 sgRNA 表达盒之间发生同源重组，从水稻克隆了 4 个不同 snRNA 启动子(OsU3,OsU6a，OsU6b ，OsU6c)，用于单子叶植物；从拟南芥中克隆了 4 个不同 snRNA 启动子（AtU3b ，AtU3d ，AtU6-1，AtU6-29） ，用于双子叶植物。4Figure 3(A) Overall structure of eight basic sgRNA intermediate vectors. (B) The two
10、 Bsa I cutting sequences are given in twelve sgRNA vectors (in a linear form), including other four vectors (pYLsgRNA-OsU3/LacZ, pYLsgRNA-OsU6a/LacZ, pYLsgRNA-AtU3b/LacZ, and pYLsgRNA-AtU3d/LacZ) that have an additional LacZ gene (198 bp) as a cloning selection marker. The U3 and U6 promoters from r
11、ice (Os) and Arabidopsis (At) and the sgRNA sequence are separated by the vector backbone, to avoid amplification of the uncut plasmids by PCR with short extension time during the construction of sgRNA expression cassettes. Cutting (small arrows) with Bsa I produces different non-palindromic sticky
12、ends to the promoters and an end to the sgRNA sequence. (C) A representative regular target and an irregular target, their target adaptors for the OsU6a promoter, and the transcribed 5 sequences are shown. A ligated target-sgRNA expression cassette is amplified by nested PCR using primers U-F/gR-R a
13、nd Pps/Pgs. Pps and Pgs are position-specific primers with Bsa I sites for the Golden Gate ligation (Table S1), or with overlapping ends for Gibson Assembly (Table S3). 3.靶位点选择和接头设计3.1 靶位点选择建议对 1 个目的基因设计 2 个靶点(尤其只有一个靶基因)，以降低某靶点打靶不成功的风险。可在ORF 5区和功能结构域各设计 1 个靶点，使之任何 1 个靶点的突变都可以产生功能缺失，或 2 个靶点之间的序列被敲除。设
14、计靶点的原则：(1) 目的基因的正链和负链靶点的打靶效率大致相同，都可以设计靶点；(2) Regular targets 另外注意设计引物（尤其反向引物）时的 5-3方向。（2 ）如果 NGG 上游第 20 碱基不是 A 或 G，作为非常规靶点(irregular target)，将 20 碱基为靶序列合成接头的形式 5-NN(T/C)NNNNGNN-3PAM5-gtcA(T/C)NNNN-33G CA5合 成 接 头 的 形 式 ：（ 对 AtU3b启 动 子 ） 20nt20nt非常规靶点（irregular target）接头的形式也就是说，所用启动子的转录起始点与 NGG 上游第 20
15、 碱基相同的 regular 靶点就是合成 19 碱基+4 碱基粘性末端(转录产生的靶点配对序列为 A/G+19 =20)；不相同的 irregular 靶点就是合成 20 碱基+4 碱基粘性末端。对使用拟南芥的 AtU3/AtU6 启动子的靶点接头也是同样道理，但对接各启动子的粘性末端不同（见Figure 3B） 。3.3 Overlapping PCR 法扩增 sgRNA 表达盒引物设计见 4.1.2（与 3.2 相同目的，自由选择用任一个方案）4. pYLCRISPR/Cas9 打靶载体构建原理4.1 靶点引物接头与 sgRNA 表达盒的连接和扩增4.1.1 sgRNA 构建方法 1 (
16、接头连接扩增法，与 3.2 对应)：6连接接头后（连接操作见步骤 5-5） ，有 3 种方法扩增 sgRNA 表达盒片段（Figure 4）：（1）直接用 Golden Gate 位置特异引物(Table S1)做一轮 PCR 扩增。此方案效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物 IV 和产物 V。（2）做 2 轮巢式 PCR，第一轮 PCR 用通用的 U-F/gR-R 做 1 个反应（引物序列见附录） ，第二轮 PCR用位置特异引物扩增。此方案扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物 IV 和产物 V（注 1） 。（3）做 2 轮巢式 PCR，第一轮 PCR 做 2 个反应，分别用 U-F/
17、接头反向引物，和用接头正向引物/gR-R；第二轮为 Overlapping PCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。虽然此方案第一轮 PCR 需要做 2 个反应，但效果最好且能避免扩增产物 IV 和产物 V，因此推荐使用此方法。Figure 4Generation of a sgRNA expression cassette by adaptor-ligation and PCR amplification在第一轮 PCR 加热过程中（ 73-75 度） ，有缺口的引物（ Tm 值低于 U3/6 和 sgRNA 序列）先解离， U3/6 和 sgRNA 序列 3端（未解离）立即延伸补平，产生接
18、头引物互补结合位点。注 1:为了提高接头连接效率，本操作中使用较高浓度（0.05 M）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接( 产物 II, III)，而环状 (双端)连接( 产物 I)较少。另外，过度酶切，星活性，过度连接等都可7能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（产物 IV 和产物 V） 。4.1.2 sgRNA 构建方法 2 （以 Overlapping PCR 往 sgRNA 表达盒导入靶序列）这种方法不需要用 Bsa I 切 sgRNA 质粒和连接反应，更加简便，不会产生上述的产物 IV 和 V。即设计的 2 条靶点引物 3端有 15-17 nt 分别与 U
19、3/U6 启动子和 sgRNA 配对，用 PCR 扩增出片段后进行第二轮overlapping PCR。Figure 5. Procedures for generation of a sgRNA expression cassette containing a target sequence by overlapping PCR. The chimeric primers with target sequence strands are given in Table S2. The first PCR can be carried out in two separated reactions
20、 with U-F/U#T#- and gRT#+/gR-R primer pair, respectively, or in one reaction with the all 4 primers. U# indicates a given promoter, and T#+ and T#- indicate strands of a target sequence.Extension2ndPCR (overlapping PCR) AnnealingTake 0.2 l PpsBsaIBsaI BsaI BsaIPCRU-FgR-RVector backboneU3/U6promoters
21、gRNAregionTarget sequence (-)Target sequence (+)1stPCRPgs1stPCRU#T#-gRT#+8TCAGCTGCAgcaagca-3GTCGCAGATCGarget squenctttOsU6aT#-gRT#+ （ 下 划 线 与 OsU6a 配 对 ）（ 下 划 线 与 sgRNA配 对 ）s6bT#- （ 下 划 线 与 s6b 配 对 ）CATGCTGCAtgactagcag-3OsU6cT#- （ 下 划 线 与 OsU6c 配 对 ）ACACGACGTCTGAGCAGTCGTGTgcagtcatgt -3OsU3T#-gR+ （ 下
22、 划 线 与 OsU3 配 对 ）靶 点 第 1碱 基 与 转 录 起 始 碱 基 相 同 (regular tget)靶 点 第 1碱 基 与 转 录 起 始 碱 基 不 相 同 (iregular trget)TGCAGTCGTCGAGCGACTGCAgcaagc-3ttatOsU6aT#-gR+19 nt20 ntOsU6b, OsU6c, OsU3 的 配 对 碱 基 与 上 面 相 同转 绿 起 始 点(为 靶 点 特 异 编 号 )Target squenc引 物 设 计 例 子Ttc（ 下 划 线 与 s3 配 对 ）4.4 靶标 gRNA 表达盒排列和扩增引物使用方法本系统目前
23、使用水稻来源的 4 个 small nuclear RNA 启动子的表达水平为 OsU6aOsU6b OsU6c OsU3a。但打靶成功效率好像与 sgRNA 的表达水平没有明显的相关性(即在水稻 sgRNA 水平不是限制性因素)。当连接靶点多于 4 个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近（2 个相邻的同向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的 1/2） 。因此建议 U3、U6ac 启动子的使用和排列方式为：1 个靶点：LacZ-U6a2 个靶点：LacZ-U6aU6b3 个靶点：LacZ-U6aU6bU6c4 个靶点：LacZ-
24、U6aU6bU6c U35 个靶点：LacZ-U6aU6aU6bU6cU36 个靶点：LacZ-U6aU6aU6bU6b U6cU37 个靶点：LacZ-U6aU6aU6bU6b U6cU6cU38 个靶点：LacZ-U6aU6aU6bU6b U6cU6cU3U3注：由于靶点接头 5端 4 个碱基形成的粘性末端是根据使用的不同启动子而不同，要注意其对应关系。sgRNA 表达盒特定位置引物对的使用方法(T1，T2 为靶序列；U#为各启动子)：1 cassette: Pps-GGL/Pgs-GGR; 扩增相应的U#-T1-gRNA2 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-
25、GG2/Pgs-GGR;扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA;93 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GG3, Pps-GG3/Pgs-GGR; 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA;4 cassettes: Pps-GGL/Pgs-GG2, Pps-GG2/Pgs-GG3, Pps-GG3/Pgs-GG4, Pps-GG4/Pgs-GGR; 扩增相应的U#-T1-gRNA, U#-T2-gRNA, U#-T3-gRNA, U#-T4-gRNA5 个或以上靶点：如此类推。4.5 靶标 sg
26、RNA 表达盒与 pYLCRISPR/Cas9 载体的连接方法本载体系统可采用 Golden Gate cloning (Engler et al., 2008; 2009), Gibson assembly 方法(Gibson, et al., 2009, 2010) 2 种策略组装 Cas9 载体和多个 gRNA 表达盒片段。Golden Gate ligation 是利用 Bsa I (type IIs restriction enzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性，可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端（256-16=240 种，减去的 16 种是回文结构；第 6-7 页的
27、 PCR扩增引物使用了 16 种） 。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接（如图 6, 4 个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接（相同末端分子间也不互补不能连接） ，因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于 OsU6a-LacZ (AtU3b-LacZ) 附有 LacZ 标记基因(198 bp)，可在含有 X-gal 的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆。Figure 6. Generation of a 4-target construct by Golden Gate cloning注：由引物 Pps-GGL 导入载体的唯一 Spe I 位点是特别留的一个“
28、后门” 。其用途是，在构建好一组目的靶点sgRNA 表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点 sgRNA 表达盒，可以用 Spe I 将载体切成线状，再用 Gibson Assembly 将第二组靶点 sgRNA 表达盒克隆进去。如果连接较多（4 个或以上）的 sgRNA表达盒的效率低（转化不能获得阳性克隆） ，就以连接产物为模板，以引物 PB-L/PB-R (见 Table S1)扩增出连接的多个表达盒，再次与 pYLCRISPR/Cas9 载体酶切连接。Golden Gate clonigctg gact tctaga ctgaT1gac(B-L) MluIMluIOsU6a
29、 (B-R)LacZ cgtaT2OsU6b T3OsU6c T4OsU3SpeIBsaIPB-L BsaIPB-R105. 载体构建操作方法：Figure 7. Working flowchart for preparation of multi-target CRISPR/Cas9 constructs（1）菌种活化和质粒提取制备：将 pYLCRISPR/Cas9 菌种(TOP10F)和 CRISPR/sgRNA vectors 菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素（25 g/ml）和氨苄青霉素（50g/ml）平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落培养 1ml 种子液，再扩大培养用于提取质粒。
30、用 2-3U Bsa I 试切150ng 质粒(10l)，电泳检查（未切的 80ng 质粒为对照） 。注：不要将保存的菌种直接接种！关键点：pYLCRISPR/Cas9 载体较大（约 1516.5 kb） ，拷贝数较低（pBR322 复制子） ，用质粒小型柱提取纯化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如 TIANGEN 公司EndoFree Maxi Plasmid Kit）提取纯化（由于溶出的质粒 DNA 可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少 DNA 溶液体积） ，或用普通碱裂解法提取（用酚/ 氯仿抽提 2
31、次后再乙醇沉淀） 。溶解在 TE（约 0.5g/l）保存。取部分质粒稀释成约 100 ng/l 冷冻保存，作为步骤（10）使用。关键点：由于接下来要用到的 Bsa I 是很容易失活的酶，有时新买的 Bsa I 也是失活的！在进行以下步骤之前，先检测 Bsa I 活性：配制 10 l Bsa I 反应液，含有 5 U Bsa I, 100 ng pYLgRNA-U#(或其它有AmpR 基因的质粒)。37反应 15min 后电泳检查，以未切的相同质粒为对照。pYLgRNA-U#的 Bsa I 图谱见 Figure 3。为了尽可能保持酶活性，最好把 Bsa I 分装成几管冷冻保存。NEB 公司的 B
32、sa I-sgRNA质 粒靶 点 设 计 ， 接头 引 物 合 成sgRNA表 达盒 连 接 物sgRNA质 粒BsaI酶 切先 切 后 连连 接 第 一 轮 PCR(每 种 2反 应 )扩 增 产 物 (混 合 )第 二 轮 PCRgRNA表 达 盒BsaI 切pYLCRISPR/Cas9质 粒Gibson Assembly引 物gRNA表 达 盒（ 边 切 边 连 ）转 化阳 性 菌 落 (蓝 色 ） ， PCR确 认 ， MluI酶 切 ， 测 序Golden Gate引 物Golden Gate 连 接 Gibson Assembly连 接（ sgRNA方 法 1） （ sgRNA方
33、法 2）sgRNA质 粒11HF 经过修饰以降低星活性，推荐使用 NEB BsaI-HF 和配套的 CutSmart Buffer。 sgRNA 表达盒构建方法 1:（2）靶点接头制备：将接头引物 TE 溶解成 100 M母液，各取 1 l加入到 98 l 0.5x TE 混合稀释到 1 M。约 90 30 s，移至室温冷却完成退火。（3）sgRNA 载体酶切：取 pYLgRNA-OsU3/LacZ 等质粒各 1 g，在 25 l 反应用 10 U Bsa I 酶切 20min，冷冻保存。关键点：不要用太多酶和太长时间过度酶切！（4）sgRNA 表达盒连接反应：酶切过的 pYLgRNA-OsU
34、3/LacZ 等质粒与各所对应接头连接反应：成分 加入量 终浓度(量)10T4 DNA ligase Buffer 1 l 1pYLsgRNA-U#质粒 0.5 l 1020 ng接头 0.5l 0.05 MT4 DNA ligase(Takara) 0.05 l 18 UddH2O 补足到 10 l室温（20-28）连接约 10-15 min关键点：过多 DNA ligase 和过长时间连接会产生较多第 6 页所述产物 IV 4 个靶点：PT1，PT2，P T3，PT4R;5 个靶点：PT1，PT2，P T3，PT4 ，PT5R;6 个靶点：PT1，PT2，P T3，PT4 ，PT5，PT6
35、R；7 个靶点：PT1，PT2，P T3，PT4 ，PT5，PT6 ，PT7R；8 个靶点：PT1，PT2，P T3，PT4 ，PT5，PT6 ，PT7，PT8R取第一轮 PCR 产物 1 l用 H2O 稀释 10 倍，各取 1 l混合为模板。各表达盒 20-50 l PCR (1 个靶点 50 l； 2-3 个靶点各 30 l；4 个或以上靶点各 20 l)。加入 1/10 量每种引物组合工作液（最终浓度0.15 M） 。使用 适量 KOD-Plus 或其它高保真 PCR 酶。扩增 17-20 循环(实际情况调整)：95 10s，58 15s，68 20 s。取 2 -3 l电泳检查产物长度
36、是否符合（注 1） ，并估计样品的大致浓度。注 1：各种启动子 gRNA 表达盒的长度为（括号为 Bsa I 切后）：单子叶表达盒 PCR 扩增产物长度（bp）BsaI 酶切后长长度（bp）双子叶表达盒 PCR 扩增产物长度（bp）BsaI 酶切后长度（bp）LacZ-OsU6a-gRNA 831 801 LacZ-AtU3d-gRNA 486 456OsU6a-gRNA 629 599 AtU3d-gRNA 284 254OsU6b-gRNA 515 485 LacZ-AtU3b-gRNA 709 679OsU6b-gRNA 924 894 AtU3b-gRNA 507 477LacZ-Os
37、U3-gRNA 766 736 AtU6-1-gRNA 487 457OsU3-gRNA 603 573 AtU6-29-gRNA 502 472（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用 PCR 产物纯化 kit 纯化。关键点：此步骤是为了除去 DNA 聚合酶，以防止下面步骤 Bsa I 酶切产生的粘性末端被补平。 sgRNA 表达盒构建方法 2 (Overlapping PCR):（8 ）取 2-5 ng pYLgRNA-OsU#质粒为模板，在一个反应中使用 4 种引物：U-F 和 gRT#+ 各 0.2 M，U#T#-和 gRT#+（Table S1）各 0
38、.1 M。25-28 循环：94 10s，58 15s ，68 20 s。 在扩增过程中，开头的若干循环时 U-F/U#T#-扩出 U#-T#序列，gR-R/gRT#+扩出 T#-sgRNA 序列。后期的循环中通过 overlapping PCR 产生 2 个片段合并的 sgRNA 表达盒片段。(9) 取第一轮 PCR 产物 1l用 H2O 稀释 10 倍，取 1 l为模板，按以上步骤（6）进行第二轮 PCR。 组装 sgRNA 表达盒到 pYLCRISPR/Cas9 载体 (策略 I, Golden Gate cloning)：13(10) 酶切-连接反应试剂 加入量（l） 终浓度10Cut
39、Smart Buffer 1.5 110 mM ATP 1.5 1 mMpYLCRISPR/Cas9 质粒 60-80 ng 4-6 ng/lsgRNA 表达盒混合物 每表达盒 10-15 ng Bsa I-HF 10 U 0.1-0.2 U/lT4 DNA ligaseH2O35 U最终 15l2-3 U/l注：每个靶点约 10-15 ng (如 1 个靶点约 10 ng、 2 个靶点共 20-30 ng、 3 个共约 40-50 ng、 4 个共约60-70 ng、更多靶点时每个片段的量适当增加（最多 15 ng/片段） 。这样载体与每种插入片段摩尔比=1: 4-6。用变温循环进行酶切连接
40、约 10-15 循环: 375 min；105 min ，20 5 min ；最后 375 min。此方法简便效率高，阳性克隆率高，推荐优先使用。冷冻保存未用完的连接产物，有必要时做下一步扩增用。注：也可以用常规的先切后连法（供参考）：取约 2-3 g pYLCRISPR/Cas9-MH (B) 在 50 l（30U BsaI）酶切 30 min, 用低熔点胶电泳回收酶切的质粒片段（去除 ccdB 片段） （不要用太多酶或太长时间过度酶切） 。用 0.5x TE 洗回收胶 30 分钟，65 3 min 熔解，在 40 加入 Agarase（1U/100l 胶， NEB)处理 30 分钟后，分装
41、成每管 40-60 ng（2-3 l）冷冻保存公用（一管做一次连接，以避免多次冻融） 。在切好分装（步骤 2）的 pYLCRISPR/Cas9 (约 60-80ng）管中，加入已用 Bsa I 酶切好的 PCR 产物（每个靶点约 10-15 ng） ，在 10 l 连接反应（加 35 U 连接酶） ， 16 （或最好用变温循环: 10 5min，20 5 min；10-15 循环）连接 2-3 h（不要过长时间连接） 。 连接效率低的补救方法：（11） 如果连接较多（4 个或以上）的 sgRNA 表达盒的效率低,即连接产物直接转化后不能获得阳性克隆，就用步骤（10）的 0.2-0.5 l连接产
42、物为模板(直接转化得不到阳性克隆的连接产物也可以作为扩增模板，因为很少的连接分子就足够被扩增了)，以 Table S1 的引物 PB-L/PB-R 扩增（40 l，用 KOD FX）(如果使用旧说明书的位置特异引物，PB-L/PB-R 要改为 PB-Lo/PB-Ro (见 Table S1 说明)。为提高扩增特异性，用热启动：先不加引物，在反应温度达到 80 度以上时介入引物（最终 0.2 M） 。10 循环：97C 10 s; 60C 20 s; 68C 3-5 min (延伸时间按 40 s/1 sgRNA 或 1 min/1kb) ;再 15 循环（循环数可调整）：97C 10 s; 6
43、8C 3-5 min。电泳回收目标片段（扩增产物可能会有非特异小片段） 。取约 20-30ng 产物与 50-60 pYLCRISPR/Cas9按以上步骤（10）再酶切与连接。注：PB-L/PB-R 位于双元载体与 sgRNA 表达盒的连接点 (Figure 4)。（12）连接产物转化（电激法）：将连接产物滴载在悬浮式透析膜 Millipore VSWP04700（0.025 m 孔径）对 0.2 x TE 透析 1530 min（最好在 4冷柜内）透析脱盐（注 1） 。取 1-1.5 l连接产物电激转化 E. coli DH10B 感受态细胞（注 2） ，电激后加入 1 ml SOC，37
44、培养 1-1.5 h。涂板培养基为 LB+ 25 g/ml Kan, 0.30.5 mM IPTG(注 3)，适量 X-gal。IPTG 诱导没有彻底切除 ccdBs 的空载质粒转化子的 ccdBs 表达致死。而含有目标插入序列（LacZ-OsU3-gRNA 表达盒）的阳性克隆由 LacZs 表达产生蓝色菌斑（注 4） 。注 1：或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，风干溶在 5 l 去离子水。注 2：化学热激法转化也可以获得阳性克隆，但效率较低。因此，有电激仪的实验室应该使用电激法。虽14然其它菌株也可以用，但 DH10B 更适合高效率电激转化大质粒。电激转化感受体态细胞制备最好用 SOB 培养（不要
45、用 LB 培养） ，以 10 pg pUC18 质粒转化测试转化效率（小质粒用电激电压1800 V/20l感受态细胞/1l 电激杯） ，要求达到效率109 colonies/1g pUC18( 即电激 10 pg 质粒，涂 1/20 转化细胞出 500 以上菌斑 )。15kb 大质粒的电激电压为 1500-1600 V/20l感受态细胞/1l电激杯（或 2500V/40l感受态细胞/2l 电激杯） ；注 3：使用 Lac Iq 基因型菌种用 1.0 mM注 4：注意：白色且生长大小正常的菌斑是已切除 ccdBs 但末端破坏平端连接的空载克隆，或 ccdBs 功能突变（有约 1/1000 频率发
46、生）但未切除 ccdB 的空载克隆。（13）提取质粒，Mlu I 酶切电泳检测 sgRNA 表达盒连接片段。 如果 Mlu I 酶切带型有疑问，用 Asc I 酶切确认。 （如果做以下步骤测序，可不做这个 PCR 检测）取少量（ 13ng）质粒为模板对所有靶点进行PCR 检测(也用空载质粒做阴性对照)。引物配对形式为： SP-DL 引物与第一靶点接头反向引物配对；第一靶点接头正向引物与第二靶点反向接头引物配对；第二靶点正向接头引物与第三靶点接头反向引物配对；第三靶点接头正向引物与第四靶点反向接头引物配对；如此类推，最后靶点正向接头引物与SP-R 引物配对。这样每个靶点的正反方向都检测过一次。电
47、泳确认其大小是否符合预期。（14）测序检测(如果步骤 13 确认了，可以不做此测序) ：利用各靶点引物的特异性，按下图方式对特定靶点进行测序。 T1 T2 T3 T#OsU6c RBSP-RT1 T2 T3 RBT#SP-L1SP-L2 SP-RpYLCRISP/Cas9Pubi-pYLCRISP/Cas9P35S-Figure 8. Strategy for sequencing of the linked sgRNA expression cassettes注：最好提醒测序公司，这是中低拷贝的较大质粒，以便公司采取相应措施。注：由于 OsU6c 比较长（742bp） ，用前一个靶点正向引物
48、不一定能测通 OsU6c 到靶序列（T#） ，如果OsU6c 是最后一个表达盒，要用 SP-R (见第 2 页) 进行测序；如果 U6c 不是最后一个表达盒，用其后面的靶点反向引物测。（15）导入农杆菌。获得的克隆电激转化农杆菌（EHA105） 。在农杆菌的稳定性检测（可以不做）：从农杆菌提取质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做 PCR） ，取约 2-5ng 质粒为模板再用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行 PCR 确认。可选步骤：或将质粒转化 DH10B，再挑取单克隆培养，并提取质粒酶切分析。(16) 获得的阳性农杆菌可用于侵染植物组织。(17) 获得转基因植株的打靶效果检测：打靶成功
49、的转化体往往在靶点产生单碱基插入或者缺失若干碱基。以 T0 植株靶点为中心，在两侧各离开约 150-200 bp 处合成引物，PCR 产物直接测序。如果出现单个碱基是杂合峰，可以判断 2 个等位基因型；如果从某个碱基以后全部是重叠峰峰，表明是杂合突变或双等位突15变，可按 Ma et al., 2015 (Mol. Plant 2015, DOI: http:/dx.doi.org/10.1016/j.molp.2015.02.012)方法进行解码；如果测序峰图无杂峰，而在靶点位置序列出现差异，可以判定为纯合突变。注 1：拟南芥 T1 代有相当多嵌合突变和杂合突变，后代分离可能不符合孟德尔分离比，还会出现新的突变。附录 1 本附录列出了使用本载体系统所必需的部分材料。其它常规分子克隆需要的材料没有列出。菌种：大肠杆菌 Top10F，用于 pYLCRISPR/Cas9 系列载体的繁殖，如果我们已经提供了含有质粒的菌种，则不需要准备。大肠杆菌 DH
