1、细菌计数参考材料一、检样稀释 1、以无菌操作用 1mL 灭菌吸管吸取 110 稀释液 1mL，注入含有 9mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成 1100 的稀释液。 2、另取 1mL 灭菌吸管，按上条操作依次做 10 倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用 1 支 1mL 灭菌吸管。 3、根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种 3 管。二、基本原理平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，
2、使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。三、器材大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基， 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有9ml 无菌水的试管，试管架和记号笔等。四、操作步骤1、编号：取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-6、10 -7 各 2 套。另取 7 支盛有 9ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明 10-1、10 -2、10 -3、10 -4、10 -5、10 -6、10 7 。2、稀释用 1ml 无菌吸管精确地吸取 1ml 大肠杆菌悬液放入 10-1 的试管中，注意吸管
3、尖端不要碰到液面，另取 1 支吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。换一支吸管自 10-1 试管吸 1ml 放入 10-2 试管中，吸吹三次，其余依次类推。整个稀释过程如图-3。3、取样用 3 支 1ml 无菌吸管分别精确地吸取 10-6、10 -7 的稀释菌液 01ml，对号放入编好号的培养皿中。4、计数培养 24 小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数 稀释倍数10一般选择每个平板上长有 30300 个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能
4、相差很悬殊。由 10-6、10 -7 两个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在 50 个左右为最好。平板菌落计数法的操作是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，待凝固后编号，并于 37温室中烘烤 30 分钟左右，使其干燥，然后用无菌吸管吸取 0.1ml 菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上 2030 分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于 37的温室中培养。五、无菌操作的基本要求
5、 1、试验开始前，应以湿式方法清洁台面和打扫室内地面，然后以紫外线或其他方法对实验室内空气进行消毒；2、实验人员应穿戴工作服、口罩、帽子；进行无菌检验时，需经风淋后进入实验室，然后，正确穿戴好无菌隔离衣、帽和口罩；3、每吸取一次不同样液应更换无菌吸管，接种环（针）需在火焰上烧灼灭菌后，才可再次使用；4、要求无菌的试剂，如蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、牛血清白蛋白、标准硬水、中和剂等，均需灭菌或过滤除菌；5、无菌器材和试剂，使用前须检查容器或包装是否完整，有破损者不得使用；6、正在使用的无菌器材和试剂不得长时间暴露于空气中；7、移液或接种时，应将试管口和琼脂平板靠近火焰，防止污染；8、
6、所有用过的污染器材，应立即放入盛有消毒液的容器中，以防止对周围环境和清洁物品造成污染；9、若不慎发生微生物培养物摔碎或其他试验微生物泄漏事故时，不论是否具有致病性，均应立即对污染及可能波及的区域进行消毒处理；10、全部试验结束后，应按常规对室内空气和环境表面进行消毒处理。六、活菌培养计数技术1、适用范围测定细菌悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌的数量。2、试验器材（1）刻度吸管（1.0ml、10.0ml）。（2）稀释液：（3）营养琼脂培养基：3、操作程序本规范要求在杀菌试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。其操作程序如下。（1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其
7、上的细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时，一般以稀释液为洗液。具体方法如下: 取含 5.0ml 稀 释 液 无 菌 试 管 ， 对 菌 片 或 小 型 固 体 样 本 直 接投 入 即 可 ， 对 棉 拭 则 将 其 采 样 端 剪 入 管 内 ， 每管一份样本。而后，用电动混合器混合20s （或在手掌上用力振敲 80 次），将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10-1、10 -2、10 -3等。（3）将菌悬液样本在用电动混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），随即吸取
8、0.5ml加至 10-1 管内。（ 4） 将 10-1 管 依 前 法 用 电 动 混 合 器 混 合 20s（ 或 在 手 掌 上 用 力 振 敲 80次 ） ，混 匀 ， 再 吸 取 出 0.5ml加 入 10-2 管 内 。 如 此 类 推 ， 直 至 最 后 一 管 。 必 要 时 ， 还 可作 某 稀 释 度 的 1:1或 1:4稀 释 。（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 15cfu300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 3个平皿。一般需接种2个3个不同稀释度。平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。（6）将 冷 至
9、40 45 的 熔 化 营 养 琼 脂 培 养 基 ， 倾 注 于 已 加 入 样 液 的 平皿 中 ， 每 平 皿 15ml20ml 。（7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置37温箱内培养。（8）每日观察细菌生长情况。培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h），计数最终结果的菌落数。（9）对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，先按各试验要求处理（如去除残留消毒剂等），而后取其最终样液按上法进行培养计数。（10）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu 300cfu的平板为准 ，每个稀释度 3
10、个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达15时，亦可用其计算最终结果。将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。菌量单位为cfu。4、注意事项（1）严格无菌操作，防止污染。（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。（3）注意菌液的均匀分散。（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。（6）
11、样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过45，以防损伤细菌或真菌。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。（8）为提高试验成功率，最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在首次试验时所取的有限稀释范围内（2个3个 稀释度）即有长菌在 15cfu 300cfu 之间的平板。（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。菌落数计算参考1计数时应选取菌落数在30300之间的平板（SN标准要求为25250个菌落） ，若有二个稀释度均在30300
12、之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告） 。2若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。3不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近
13、） ，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等） ，不应作为检样计数报告的依据。4当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。5当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时） ，但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该
14、平板的菌落数。6菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g）为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm 2）报告。兽药典的活菌计数法取菌液或疫苗（如果为冻干苗，则先加原装量510倍量稀释液作放大稀释）进行稀释，在一定条件下培养，所得细菌菌落数乘以稀释倍数，即为其活菌数。按下列方法测定。1、表面培养测定法每个样品取1.0ml，用各制品适宜的稀释液做10倍系列稀释，每个稀释度换1支吸管。具体方法是：准确吸取菌液1.0ml，放入盛有稀释液9.0ml的第1支试管中（不
15、接触液面） ，另取1支吸管将第1管液体混合均匀后，吸取1.0ml放入第2管中，依次稀释至最后一管，根据对样品含菌数的估计，选择适宜稀释度，吸取最终稀释度的菌液接种适宜的培养基平板3个，每个平板0.1ml，使菌液散开，置37晾干后，翻转平板，培养2448小时（亦可适当延长） 。2、混合培养测定法稀释法同上，取最终稀释度的菌液接种平板3个，每个1.0ml，然后将溶化并冷至45的普通琼脂倾注入平板中，轻轻摇动平板，使稀释的菌液与培养基混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平板，置37培养2448小时（亦可适当延长） 。3、菌落计算肉眼观察菌落，并在平板底面点数，算出3个平板的平均菌落数，乘以稀释倍数（表面培养法应乘以10） ，即为每1.0ml原液所含的总菌数。最终稀释度一般选择每个平板菌落数为40200CFU的稀释度。如果有片状菌落生长，或同一稀释度平板间菌落数相差50以上时，应重检。
