1、microRNA 作为靶点在药物设计中的应用摘要：微小 RNA（microRNA）是一类长约 22 bp 的非编码单链 RNA，由前体经酶作用而得，它是细胞的内源性物质，普遍存在于动植物中，高度保守，在生命体的生长、发育、疾病发生发展的过程中起到了基因调控作用，它与重大疾病，如肿瘤、心脏疾病、神经性疾病等都有着密切的关联，因此成为新药开发的一个重要新靶点，以它为靶点的药物设计和药物研发工作也在不断探索中。本文就其作用机制、生物功能、与疾病的关系以及以 microRNA 为靶点的药物设计的研究情况进行了综述。关键词：microRNA ；靶点；药物设计1993 年 Lee 等 1在对秀丽隐杆线虫（
2、 Caenorhabditiselegans）进行遗传分析时发现了第一个 microRNAlin-14，它的长度为 22bp，它是一个非编码的单链 RNA，可以控制细胞的发育，通过反义的 RNA-RNA 反应在转录后水平下调 lin-14 蛋白的表达。2000 年 reinhart 等 2发现了第二个 microRNAlet-7，它在线虫的发育过程中可以下调 lin-28 和 lin-41 的表达。2001 年 Lee 等 3通过 cDNA 克隆和对生物资料的分析，在秀丽隐杆线虫中又发现了 15 种新的 microRNA，其中有 3 种在哺乳动物以及昆虫中有明显的同系物。同年 Lau 等 4也
3、报道了 55 种之前在线虫中不知道的 microRNA，其中一些在果蝇和人类的基因组中也有发现。Lagos-Quintana 等 5在 2001 年报道 microRNAs 存在于脊椎和无脊椎动物中。microRNAs 广泛存在，高度保守及其表达方式，都说明它在动物中具有广泛的调节功能。因此在随后的研究中，许多的实验室相继发现了更多的 microRNAs，这使得其家族迅速扩增，到 2003 年就已经有 200 多个成员了 610 。到 2010 年，在人体内确认存在的 microRNAs 有 800 多个。有研究表明 microRNA 可能与疾病发生有密切的关系，在不同类型疾病的发生过程中，m
4、icroRNA 的水平及其调节作用是不同的。鉴于 microRNA 的重要性，本文归纳了近年来在该领域研究中的关键问题，总结了 microRNA 的作用机制及其作为小分子药物作用靶点研究的主要进展，其在疾病发生发展过程中的重要性及潜在应用前景，以此为线索，对设计合成新一类基因治疗药物的研究前景进行了展望。1 microRNA 的作用机制及其生物学功能microRNA 是一个长度为 1826 个核苷酸的小分子单链非编码 RNA，是生物体内源基因转录形成分子内或分子间双链结构后，经 RNAse酶、DGCr/Pasha 以及 Dicer 酶作用产生。大多数 microRNA 由位于基因间隔区的核苷酸
5、序列编码，转录方向与相邻的基因往往相反。另一类位于基因内含子中的microRNA，随着基因 mRNA 转录而包含在 mRNA 的前体中，转录方向与对应的基因一致，此类 microRNA 的表达具有组织特异性 11。microRNA 广泛存在于生物中，它是一个重要的基因调节子。microRNA 的功能遍布生命体的发生、生长、发育、分化、信号转导、疾病和死亡的各个阶段。多种 microRNAs 在细胞内的表达，使得细胞处在一个受内源性 microRNA调节的环境中，维持着细胞内 mRNA 的水平，从而使各种蛋白质的水平处于一个正常范围。因此 microRNA 与许多疾病有着密切的关系。但是，由于每
6、个microRNA 具有调节数百甚至数千 mRNA 的能力，导致 microRNA 作用缺乏基因特异性，这在一定程度上阻碍了其作为基因诊断和治疗靶点的应用。有趣的是，在心脏、脑、肝脏等不同的组织中，都有特异性 microRNA 占主导地位，提示其在组织分化过程中发挥重要作用 6。目前已有证据提示在包括癌症在内的一系列人类疾病中 microRNA 可能是新的治疗靶点。2 microRNA 与疾病的关系21 microRNA 与肿瘤microRNA 与多种肿瘤的形成、癌症发生都有着密切的关系。Calin 等 12发现在慢性淋巴细胞白血病中 mir15 和 mir16 双双下调。Lu 等 13报道从
7、microRNAs 的表达谱可以区分出低分化的肿瘤，这一现象也说明 microRNAs 与肿瘤的分化有关联。另外研究也证明 microRNA 与癌症（如乳腺癌）的转移也有关联，在乳腺癌的恶化进程中起到促进或抑制作用。He 等 14指出 microRNA可以调节肿瘤的形成，而且暗示 mir17-92 簇是一个潜在的人类致癌基因。另外Satzger 等 15提出 mir-15b 与恶性黑色素瘤的增殖和凋亡都是相关的。Nakano 等16通过功能筛选得到了 microRNA491，它在结肠直肠瘤细胞中以 bcl-X(L)为靶点诱导细胞的凋亡。这些实验结果都很好证实了 microRNA 与肿瘤有着密切
8、的关系，它可以作为一个检测和治疗肿瘤的靶点。由于最近提出的原癌 microRNA 组学(Oncomirs) 17这一崭新概念，将调节microRNA 的小分子物质应用于肿瘤细胞的研究具有很大潜力，这一理论假设具有一定的事实基础，因为 microRNA 可调节很多与真核生物生存和增殖密切相关的基因，且 microRNA 是完全天然的内源性反义调节因子。另外，Meng 等18首次报道了应用化疗药物作用于人类癌细胞可影响 microRNA 的表达，该研究发现给予 gemcitabine(2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷)可改变 microRNA 的表达，体外调节某些 microRNA(例如上调 miR-2
9、1)还可增加胆管癌细胞对该化疗药物的敏感性。以上结论为 microRNA 作为肿瘤治疗靶点提供了实验基础。最近还有研究表明 microRNA 具有肿瘤抑制因子和原癌基因的功能。与应用可编码蛋白质的基因作为癌症分型方法相比，应用 microRNA 更加精确，不同肿瘤细胞表达的某一特定 microRNA，其不同的表现形式可能成为诊断和治疗肿瘤的有利工具。基于 microRNA 的基因治疗可能成为抑制肿瘤恶化的有效途径。例如le-t7，在肺癌 19及结肠癌 20细胞中其表达量降低，研究表明其可下调 Ras 和 c-Myc 蛋白表达，因此可转染 le-t7 从而抑制上述两种肿瘤细胞的生长；但在胆管癌细
10、胞中，Meng 等 21通过转染技术使白细胞介素-6(IL-6)过表达，则 le-t7a 表达水平也相应升高，已知 IL-6 可促进肿瘤细胞生长并抵抗化疗药物作用，该研究组发现 le-t7a 的靶基因是 neurofibromatosis 2，而该基因的表达产物可调节信号传导与转录活化因子-3( signal transducers and activators of transcription，Sta-t3)的磷酸化过程，即 IL-6 表达水平持续增高并维持肿瘤细胞生长的过程中， le-t7a 抑制抑癌基因 neurofibromatosis 2 的表达，导致 Sta-t3 磷酸化作用增强并
11、启动肿瘤细胞生存通路，因此，在这类肿瘤细胞中应抑制 le-t7a 的表达。而 miR-15 和 miR-16 对 BCL-2 具有负性调节作用并诱导白血病细胞凋亡 22，它们都可能成为肿瘤治疗的候选分子。2.2 microRNA 与心脏疾病2002 年，Lagos-Quintana 等 6克隆了成年小鼠不同组织的 microRNA，其中miR-1 和 miR-133 在心肌组织表达量最为丰富，且具有一定组织特异性，说明两者在原始细胞向心肌细胞发育的过程中发挥重要作用。Chen 等 23验证了miR-1 和 miR-133 在心肌和骨骼肌的表达，并研究了两者在肌细胞增殖和分化过程中发挥的功能。m
12、iR-1 和 miR-133 在小鼠 2 号染色体和 18 号染色体均成簇表达，且同时转录。研究人员检测了胚胎鼠、新生鼠和成年鼠骨骼肌 miR-1 和miR-133 的表达，发现伴随发育进程，两者的表达量逐渐增多。进一步研究发现两者发挥的功能却截然不同，miR-1 促进肌原细胞分化，而 miR-133 可刺激肌原细胞增殖，说明两者在骨骼肌和心肌表达的时向性和数量，对于骨骼肌和心肌的不同时期发育过程具有重要作用。近年来，对不同病理条件下心肌 microRNA 的研究逐渐增多。Zhao 等 24应用基因敲除技术研究 miR-1-2 在小鼠心脏发育过程中的作用，发现敲除 miR-1-2基因的小鼠死于
13、先天性室间隔缺损的几率大大增加，可能与调节心脏发育的转录因子 Hand2 过表达有关；另一些存活的小鼠则由于出生后心肌细胞持续分裂而导致心肌肥大并伴有心律失常，miR-1-2 的靶基因 Irx5 表达异常增高，而Irx5 可抑制 Kcnd2 基因，使 K+通道亚单位 Kv 412 表达减少，心肌细胞复极异常。心肌肥大是一种多基因遗传病，但其发病机制尚不明了。Van Rooij 等 25应用转基因动物和离体心肌细胞两种心肌肥大模型，发现并验证了 7 种上调的microRNA (miR-21、miR-23 、miR-24、miR-125b 、miR-195、miR-199 及 miR-214)和
14、4 种下调的 microRNA(miR-29c、miR-93、 miR-150 以及 miR-181b)。对于心肌肥大引起的心衰，上调的 microRNA 与心肌肥大相似，提示它们可能参与调控心肌组织的病理性重塑过程。进一步研究证实，过表达 miR-195 不但可以使体外培养的心肌细胞肥大，还可使转基因动物产生心肌肥大，表现为左心室壁薄，左心室内径增大以及心功能降低，并最终导致心衰。Sayed 等 26同样研究了 microRNA 与容量负荷所致心肌肥大的关系。在众多 microRNA 中，miR-1 表达量下降。与在骨骼肌中的作用相似，miR-1 受 SRF 调节，随年龄增长，其表达增多，心
15、脏不再生长，但当其受多种因素影响而下调时，则可导致心脏的肥大，推测其作用靶点可能是 RasGTP 酶-活化蛋白 (RasGTPase-activating protein， RasGAP)、周期素依赖性蛋白激酶 9(cyclin-dependent kinase 9，Cdk9)、脑内 Ras 同系物(Ras homolog enriched in brain，Rheb)以及纤维结合蛋白(fibronectin)。伴随心肌肥大过程，miR-21 上调，该 microRNA 具有抗凋亡活性，是肿瘤发生发展过程中的活跃分子。心脏负荷过大可导致凋亡，初期，心脏可通过使心肌细胞变肥大和激活抗凋亡通路产生
16、补偿机制，miR-21 的上调可产生强大的抗凋亡作用，因为其可同时调节多种凋亡基因，预测其作用位点为 Fas配体(Fas ligand)和转化生长因子-B 受体(transforming growth factor-Breceptor，TGF-Breceptor)。2.3 microRNA 与神经系统疾病microRNA 参与调控神经系统的生长发育和生理功能。它与突触生长和可塑性障碍相关的疾病发生有关。Schratt 等研究发现 mir-134 参与调节树突棘发育、成熟和可塑性 27。哺乳动物脆性 X 智力低下蛋白（FMrP ）能够与 microRNA 和与之相关的 Dicer 酶以及 AG0
17、1 蛋白分子结合，通过 microRNAs 来调节神经元的传输。不仅如此，目前研究较多的神经退行性疾病也与 microRNA 相关。在患有神经退行性疾病的患者体内，mir-9、mir-125b 和 mir-128 都被发现有下调的现象。mir-8 的直接底物是阿托品， mir-8 的突变体可以提高阿托品的活性，结果导致果蝇脑内神经元的凋亡以及行为的缺失 28，表明 microRNA-8 与体内的阿托品的调节是相关的。microRNA 与其他的神经疾病也密切相关，如 mir-383 和 mir-132 分别和血管源性脑水肿相关的两种蛋白AQP4，MMP9 的表达变化一致。3 以 microRNA
18、 为靶点的药物设计3.1 microRNA 作为药物靶点因为 microRNA 与许多重要的疾病有着密切的关联性，所以 microRNA 已经成为人们关注的焦点。它作为药物研发的重要靶点，可设计相应的药物，通过上调或下调 microRNA 或使基因沉默等来达到治疗目的。目前，基于microRNA 的分子药物设计尚处于起步阶段，研究主要集中于模拟 microRNA，增强其对靶基因的作用效能，或以 microRNA 为靶点设计小分子物质拮抗microRNA 的作用，如 microRNA 反义寡聚 (脱氧)核苷酸 (anti-microRNA oligonucleotides，AMOs)以及 mic
19、roRNA 拮抗分子 (antagomirs) 等 29。AMOs是指与体内 RNA 序列具有互补序列，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其翻译过程。AMOs 既可以与成熟的 microRNA 互补，也可以与其前体互补。最早的关于 AMOs 抑制 microRNA 的报道是静脉注射 DNA 寡核苷酸（其长度和互补的目标 microRNA 一致）到小鼠的胚胎中，但是未经修饰的这段DNA 寡核苷酸在体内会被酶降解，不能发挥作用。于是人们开始对 AMOs 进行化学修饰，以便提高其稳定性和亲和力。最为常见的修饰有以下几种 ：1）2-O-甲基修饰，该基团是最早的、最简单的也是比较常用的修饰基团，可以
20、防止核酸酶的作用，也可以提高 AMOs 与 microRNA 的亲和力。Hutvagner 等报道了用 31-mer OMe-AMOs 在 Hela 细胞中成功抑制了 let-7（一种 microRNA）的功能；2）2-O-甲氧乙基修饰，该基团比 2-O-甲基具有更高的亲和力和特异性。Esau 等用 MOE-ASOs 发现 microRNA143 参与调节 ErK5 蛋白的表达；3）锁核酸 (locked nucleicacid) (LNA)-AMOs，这种修饰是指通过一个亚甲基将 2-O-的氧基与 4位置相连形成一个刚性的环，嵌入糖基的 C3 位置。LNA-AMOs具有很高的选择性和灵敏度
21、30，也是一个研究的热点 31。另一种研究较多的 microRNA 拮抗物质为 antagomirs，它已经成功地在培养的细胞中抑制 microRNA 的作用，但在动物模型中还有待研究。Krutzfeldt 等32以 2-O-甲基糖基的磷硫酰作为骨架，设计能在 3端与胆固醇共价结合、且与成熟的目标 microRNA 序列互补、被称为 antagomirs 的长度为 2123 个核苷酸的单链的 RNA 分子，通过静脉注射给药，在肝脏、肺和骨髓等中成功地沉默了 microRNA 的表达，药效维持了 1 周多。还有研究发现用 antagomirs 沉默microRNA122 的表达后使小鼠体内的血浆
22、胆固醇水平下降、脂肪酸合成减少，表明抑制 microRNA 的表达可以作为疾病治疗的一个新方法。随后的深入研究结果表明，在设计寡核苷酸药物时，应尽量减少脱靶效应，并发现位于 5端或者中间位置的核苷酸序列发生变化并不影响目标 microRNA 的表达；修饰用的磷硫酰的数目应该适当，只有适当的磷硫酰才可以有效地提高其效率；而且antagomirs 的长度最好大于 19bp。他们还发现通过靶向注射 antagomirs，可有效地减少小鼠脑内的 microRNA16 的水平。这些实验结果进一步说明了antagomirs 是研究 microRNA 功能的一个有力工具，也是非常有潜力的治疗与microRN
23、A 相关疾病的手段 32。基于 microRNA 可直接调控某些致病基因的转录及翻译，可根据特定靶基因的 3端的非翻译区（UTR）设计模拟 microRNA（microRNA mimics）寡核苷酸链，使其 3端和 5端分别有大约 6 个核苷酸与靶基因 3端的 UTR 序列互补。模拟 microRNA 的大小约为 22bp，具有基因特异性，可对目的基因进行封闭；可模拟体内 microRNA 的作用，用于研究 microRNA 的功能；也可以作为一个正确的基因序列，治疗由于基因缺失或者功能受损而导致的一些疾病。3.2 基于 microRNA 的药物研发2008 年核酸药物的历史翻开了新的一页。丹
24、麦制药公司 Santaris Pharma 宣布将实施世界首例以 microRNA 靶点药物临床试验。他们进行了核酸药物SPC3649 的 1 期临床试验，其适应证为丙型肝炎治疗 33。2010 年，该制药公司又与冷泉港实验室合作研究，发现设计的 microRNA 药物不仅仅作用于特定的 microRNA，而且也可作用于一个 microRNA 家族。寡核苷酸长度在 8-mer 为最佳，它的序列与 microRNA 家族的种子区域（不同的 microRNA 在 5端所共有的一段区域）互补就可以很好地抑制 microRNA 的作用，使之沉默，在体内药效维持的时间也比较长久。很重要的一点是它没有肝毒
25、性，只需要连接一个磷酸骨架而不需要其他的修饰就可以到达病灶。在小鼠的乳腺癌模型以及肝脏中的实验都获得了成功，这为 microRNA 药物的开发提供了新的思路。小分子抑制剂也有望成为一个治疗与 microRNA 有关疾病的方法。最近Gumireddy 等 34通过基于细胞的高通量筛选发现，小分子化合物偶氮苯 2 能特异性抑制 mir-21（常在几个肿瘤和心肌疾病中过表达）的表达。因此可以通过对小分子药物库进行高通量筛选，找到更多的 microRNA 小分子抑制剂，这也为我们的 microRNA 药物研究提供了一个方向。3.3 microRNA 在药物研发中的其它应用科学家们发现，microRNA
26、 与功能基因结合的位点或者周围的多态性，会影响 microRNA 功能的表达。 Mishra 等 35发现在人二氢叶酸还原酶基因 3UTR中邻近 microRNA 结合位点的 SNP829 位的 C 变成了 T，这一遗传变异归因于mir-24 结合功能的丧失，结果导致了二氢叶酸还原酶的过表达及对甲氨蝶呤治疗的抗性。microRNA 基因、 microRNA 靶点或 microRNA 加工机械的功能变异可阐明这种所观察到的药物有害反应。为防止这些药物有害反应的产生，业界呼吁医生开处方前先进行强制性的基因测定，以提高药物的有效性和安全性。“一个药治疗所有人 ”的中心法则的终结即将到来，将来个体化药
27、物似乎是一个必须要面对的现实。在药物载体方面，Kota 等 36在小鼠肝癌模型中用腺相关病毒（AAV）将 mir-26a 成功运输到体内，而 AAV 非但不会整合进人体的基因组，还可以很好地定位于肝细胞，为肝癌的治疗提供了新的希望。4 展望鉴于 microRNA 在疾病治疗以及药物开发方面的前景趋于光明，有关的研发工作正在如火如荼地进行着。寻找 microRNA 的调控基因以及靶基因，揭示其在疾病中的作用机制是一个重点和难点，需要人们继续深入地研究，从而充分发挥其疾病治疗的作用。对于现存的拮抗剂，要想将 microRNA 药物运用于临床，应该考虑有效的载体和化学修饰的问题。另外为了打破以前药物
28、作用靶点单一的问题，需要设计多靶点药物，而基于 microRNA 的药物可能是达到这个目标的重要途径之一，为此，找出它们共有的种子区域并据此开发多靶点药物是今后研究工作的一个重要方面。目前，在基于 microRNA 研发药物方面所面临的最大问题是寻找合适的给药途径和药物的靶向化，还需进一步的探索实践。相信随着新技术的出现和应用，以及对 microRNA 研究的不断深入，一定会出现以其为靶点的新药和治疗的新方法，为人类的健康带来新的希望和突破。参考文献：1 Lee rC，Feinbaum rL，Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 e
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