1、色谱法原理及应用,2019/2/16,1,Cap.1 色谱的发展故事,2019/2/16,2,色谱的起源,色谱法起源于20世纪初，1900年俄国植物学家米哈伊尔茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。该实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为，译为色谱。,Mikhail Tsvet 1872.05-1919.26,2019/2/16,3,植物色素分离,1931年德国柏林威廉皇帝研究所的库恩将茨维特的方法应用于叶绿素和叶黄素的研究，使用氧化铝作为固定相，奠定吸附色谱的
2、基础。现今，以石油醚-丙酮作为洗脱剂，使用薄层层析板（正相硅胶-铝薄板）对植物色素进行分离，如右图。,薄层层析,新叶黄素,叶黄素,叶绿素B,叶绿素A,脱镁叶绿素,2019/2/16,4,色谱分析法普及,1938年阿切尔约翰波特马丁和理查德劳伦斯米林顿辛格分离不同种类的氨基酸，他们将氨基酸水溶液吸附在固相的硅胶上，以氯仿冲洗，成功地分离了氨基酸。,硅胶 Silica gel,氯仿 Chloroform,2019/2/16,5,诺贝尔化学奖（1952）,Richard Laurence Millington Synge,Archer John Porter Martin,2019/2/16,6,气
3、相色谱出现,1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸。色谱技术和理论的发展： 色谱技术标准化、自动化 检测器的开发 塔板理论和Van Deemter方程 保留时间、峰宽、分辨率等概念,2019/2/16,7,高效液相色谱问世,20世纪60年代末，科克兰（Joseph Jack Kirkland）等人开发世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几
4、个小时甚至几十分钟内完成。,液相色谱现代实践,2019/2/16,8,Cap.2 色谱法的原理及分类,2019/2/16,9,什么是色谱法,色谱法（Eng：Chromatography，又称层析）是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。三级学科-色谱学 关键词-流动相、固定相、吸附、洗脱、分离。,2019/2/16,10,色谱法分离原理,2019/2/16,11,亲和色谱法 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异
5、性亲和力，进行选择性分离。主要用来从细胞提取物中分离纯化核酸、蛋白等。 Step 1：建立平衡 Step 2：进样、洗涤 Step 3：洗脱,凝胶过滤层析 也叫做分子排阻层析SEC，一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来，小分子后流出来。,色谱法分类（按色谱介质分）,2019/2/16,12,柱色谱法（Column chromatography） 纸色谱法（Paper chromatography） 薄层层析（Thin layer chromatography）,色谱法分类（按流动相物理状态分）,2019/2/16,13,气相色谱（G
6、C） 高效液相色谱（ HPLC） 亲和色谱（Affinity chromatography）,Cap.3 相关名词解释,2019/2/16,14,色谱图（一）,2019/2/16,15,色谱图（二）,2019/2/16,16,问题分析,2019/2/16,17,噪音,漂移,积分线,未分离,峰面积计算,2019/2/16,18,分辨率计算,2019/2/16,19,分辨率区别,2019/2/16,20,R1,R1.5,固定相 Stationary Phase,2019/2/16,21,流动相 Stationary Phase,2019/2/16,22,固定相/流动相如何作用,2019/2/16,
7、23,Cap.4 HPLC-1260,2019/2/16,24,问题一：HPLC是什么？,2019/2/16,25,A1. High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱,问题二：HPLC的特征？,2019/2/16,26,A2. 经典LC与HPLC比较,问题二：HPLC的特征？,2019/2/16,27,液-固色谱法（反相）,2019/2/16,28,流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。 流动相的极性大于固定液的极性。,固定相-C18柱,2019/2/16,29,型号：ZORBAX Eclips
8、e XDB-C18 填料：SiO2,流动相,2019/2/16,30,乙晴 0.2%醋酸,问题： 乙晴是极性还是非极性？ 醋酸的作用？,分析物质,2019/2/16,31,主要物质： BPA,其它物质： Phenol ISTD BPE IPP o,p- BPA CD-2 Triphenol Chroman,T-550.M,2019/2/16,32,作用原理,2019/2/16,33,弱,强,疏水性,疏水性强弱,2019/2/16,34,如果样品有： CH2CH2CH3 ： 碳链：芳香基,如果样品有： COOH： 羧基 OH：羟基 NH2：氨基,疏水性强,疏水性弱,HPLC重要组成,2019/2
9、/16,35,Cap.5 GC-7890A,2019/2/16,36,问题一：GC是什么？,2019/2/16,37,A1. Gas Chromatography气相色谱,问题二：GC的原理？,2019/2/16,38,A2. GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。,样品,进样气化,色谱柱分离,检测器,载气,信号记录,固定相-毛細管柱,2019/2/16,39,型号：DB-WAX 125-7032 填料：SiO2,流动相-载气,2019/2/16,40,氦气 He 氮气 N2,分析物质,2019/2/16,41,前座FID： 甲醇 1-C250.M 苯酚 1-PHE
10、NOL.M 丙酮 1-ACETONE.M,后座TCD： 甲醇-水 2-V255.M ETBZ 2-C220V225.M,1-C250.M,2019/2/16,42,40C,80C,180C,GC重要组成,2019/2/16,43,气路,进样,检测,温控,分离,进样器,2019/2/16,44,FID vs. TCD,2019/2/16,45,FID与TCD比较,Cap.6 分析方法,2019/2/16,46,定性分析,2019/2/16,47,色谱定性分析能力较IR/MS/NMR差。 利用保留时间定性。 利用相对保留时间定性。 利用已知物增加峰高法定性。,定量分析-概念,2019/2/16,4
11、8,色谱分析的重要作用就是对样品定量，依据组分的含量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。 定量公式可表示为：wi = fi Si，其中wi为待测组分i的含量，Si为组分i的峰面积，fi为比例系数（定量校正因子）。 如果要确定wi，只需准确测出峰面积Si与比例系数fi 。,定量分析-归一化法,2019/2/16,49,举例说明： 色谱图中总共出现3个峰，分别记为A、B及C，积分测得其对应面积为SA、SB及SC。 由此可计算：,定量分析-外标法（校正曲线法）,2019/2/16,50,举例说明： 精确配制A物质标准溶液浓度100ppm、300ppm及500ppm，进样后测得各峰的面积为S1、S2及S3。再次测含A待测样品峰面积为Sx，其中wx求法如下：,w/ppm,100,300,500,S3,S2,S1,Sx,wx,S,wx = f Sx +b,定量分析-内标法,2019/2/16,51,举例说明： 测得内标品含量为w0，内标品峰面积为S0；待测样品峰面积为Sx，峰总面积为S，求待测样品含量wx。,问题？感谢！,2019/2/16,52,
