1、PCR 技术原理及应用生物工程 072 程世杰 200710734211摘要：PCR 特异性依赖两端的引物，经高温变性低温复性中温延伸循环倍增，底物为四种脱氧核苷酸，需要耐高温 DNA 聚合酶。主要应用在生物学和基因工程实验室、疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新的医药与工农业制品等领域。PCR 技术全称为聚合酶链式反应（Polymerase-Chain-Reaction ）是上世纪 80年代发展起来的新技术，发展至今已相当成熟，被广泛应用于分子生物学和基因工程实验室、疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新的医药与工农业制品等领域。基本原理PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然
2、复制过程，其特异性主要依赖于和靶序列两端互补的寡核苷酸引物，它由变性复性延伸三个基本反应步骤构成。首先，根据靶序列 DNA 片段两端的核苷酸序列，合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与 DNA 的两条链互补配对。将适量的寡聚核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷三磷酸（dDNA） 、DNA 聚合酶以及含有靶序列片段的 DNA 分子混合，经过高温变性使 DNA 双链解开、低温复性使底物与模板附着和中温延伸合成新的 DNA 片段这三个阶段的一次循环， DNA 的量即可增加一倍，而循环n 次，则 DNA 的量增加 2n 倍，如（图 1）图 1 .聚合酶链式反应示意图【M 】扩增反应（ ）迅速地循环，产生了大
3、量相同的片段，每一片段中均包含目的 1 4DNA 片段（1）模板 DNA 的变性：模板 DNA 经过加热至 94左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，完成下一轮扩增反应；（）模板 DNA 与引物的复性：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸：DNA 模板 -引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列 DNA 序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，从 5端到 3端延伸出一条新的与模板链互补的半保留复制连，重复循环变性
4、复性延伸三个过程就可获得更多的“半保留复制连” ，以这些新链为模板就可进行下一次的 PCR 循环。PCR 技术的应用一、在医学中的应用1)在传染病的诊断和研究中的应用目前 PCR 在临床上应用广泛，其中前景最为广阔的是对传染病的诊断和研究。因为传染病的病原体无论是细菌，还是病毒或寄生虫，对于机体来说，就是一种外源入侵者，不论其致病是否由基因所致，只要病原体存在，机体内就会有其核酸存在，而且这种核酸顺序与人类基因组顺序往往不同，所以选择PCR 技术进行诊断较细胞培养法、血清学方法更为简便、敏感和快速。在检测病毒方面，做得比较多的是对结核、麻风、沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等的检测和研究。
5、在检测病毒方面，做得比较多的是对艾滋、人乳头状瘤病毒、人 T 细胞淋巴瘤病毒、EB 病毒、肝炎病毒等的研究。以前 AIDS 病的诊断主要采用的是血清学的方法。虽然血清学试可以确定是否接触过 HIV 病毒，但它不能确定是否存在 HIV 感染。因为 HIV 感染者的外周血淋巴细胞中仅万分之一含有病毒RNA，所以采用体外培养来使 HIV 病毒繁殖，往往需要三到四周，而且不稳定。如果采用 PCR 技术来扩增 HIV 病毒的保守序列，再鉴定 HIV 病毒，则不仅使诊断的敏感度大大提高，而且时间也大大缩短。目前，国内用 PCR 检测病毒方面做得最多的是对肝炎病毒的检测，包括乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型
6、肝炎病毒、戊型肝炎病毒。采用 PCR 检测法可以测出每毫升血中仅 0.4fg 的乙肝病毒 DNA，相当于 130 个病毒颗粒，其敏感度高于传统的检测法 1000 倍。可以清楚地看到，PCR 以其特异、快速、敏感的特点必将成为临床微生物实验室的常规检测手段。2）PCR 在遗传病的诊断和研究中的应用遗传病是一大类严重危害人类健康、影响人口质量的疾病。有些遗传病在胎儿出生后有一定的治疗手段，这一类遗传病如早期发现，便可早期治疗，防止其并发症特别是不可逆性的后果发生。而另一类遗传病目前尚无有效疗法，就应在患儿出生前做产前诊断，确诊后进行人工流产或引产，以保证人口质量，减少家庭和和社会负担。目前对遗传病
7、的基因诊断方法主要是用 DNA 分子杂交和 RFLP（restriction fragments length polymorphism，限制性酶切片段多态性）的方法，比较复杂、费时而且费用昂贵，PCR 则为遗传病诊断提供了快速、简便而准确的手段。目前国内外采用 PCR 诊断的遗传病已有数十种，最常见的有-地中海贫血、 - 地中海贫血、镰刀状红细胞贫血、血友病（甲型、乙型） 、苯丙酮尿症、肌营养不良症（DMD）亨延顿氏舞蹈症等。这些都是由于基因的突变缺失或重拍造成的遗传病。镰刀状红细胞贫血是由于正常人的 -珠蛋白链第 6 位上正常的谷氨酸突变成缬氨酸所致，用一对引物扩增含有突变部位的 DNA
8、片段（294bp） ，产物用限制性内切酶 UxaNI（能特异性辨认 GG TNAGG）消化后，琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色观察。正常人（ s s）有三个扩增片段 191bp、103bp 和 294bp。DMD 是男性中常见的一种性连锁致死性遗传病。DMD 基因的双链 DNA 为14kb，序列已经清楚，大约 50%60%的病人存在基因的部分缺失。用双链 DNA探针做 Southern 印迹可以检测基因的缺失，但必须用十余个探针，步骤多、时间长并且需要大量的完整的基因组 DNA。Caskey 等设计了多重 PCR 扩增系统，即加入多对位于一缺失的外显子中的引物，同时扩增。扩增后的产物可直接电泳观
9、察，如有某个外显子缺失，就看不到相应的条带。这种方法快速、灵敏，可查出缺失型中的 70%80%。3）在肿瘤的诊断、研究及残留癌细胞中的应用肿瘤的发生与演进是一个多阶段的过程，其中包括多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，一起上述改变的遗传学基础主要是点突变、重排、扩增和缺失等。PCR 技术为检测这些异常提供了敏感、快速和特异方法，这不仅促进了肿瘤分子遗传学的发展，并为临床肿瘤学上的应用开创了新的条件。（1）癌基因激活的检测点突变的检测 应用 PCR 技术检测点突变，须与其他技术相结合，主 1要方法有以下几种。a、 设计引物位于常见的点突变部位，在严格条件下进行扩增，由于突变碱基影响了引物的结合与延
10、伸，结果无产物形成。b、 引物位于点突变两侧，当点突变引起限制性内切酶识别为点的改变时，则可用相应的内切酶处理扩增产物，可作出明确判断（PCR_RFLP） 。c、 扩增的靶 DNA 片段与标记的等位基因特异性寡聚核苷酸探针（ASO）进行杂交。在严格杂交条件下，根据与何种 ASO 探针杂交，可判断有无突变及突变的类型（） 。d、 扩增的片段直接进行顺序分析，可直接测出突变点。e、 产物单链构像多态性分析（） ，这一方法是根据同一顺序位置的不同碱基替换，以及同一碱基在不同位置的替换，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上有不同的 迁移率，来对基因突变作出分析。嵌合基因的检测 某些人类恶性疾病，如滤泡性淋巴瘤
11、等，具有特异性染 2色体易位，因此形成了由不同基因组成的嵌合（融合或杂交）基因。因为在正常组织细胞中不存在这类嵌合顺序，所以用于易位点两侧顺序互补的引物，扩增基因组时则无靶片段形成；如检测标本中存在携带易位的恶性细胞则有特异性片段的扩增产物。癌基因扩增的检测 目前在多种人类的肿瘤中，观察到约多种癌 3基因的扩增去，其中乳腺癌的 c-erbB-2 癌基因和神经母细胞瘤的 N-myc 癌基因的扩增提示临床预后不良；另一方面，近年来的研究还发现，许多肿瘤对抗癌药物的抗药性，与 p 糖蛋白基因的扩增有关。因此新近发展起来的定量 PCR 技术对癌基因的扩增检测，具有明显的实践意义。（2）抑癌基因失活的研
12、究抑癌基因（肿瘤抑制基因）是其正常产物可防止细胞癌变的一组基因，它们的功能可能与细胞分化和控制细胞增殖有关。当抑癌基因的一对等位基因均丧失功能（失活）时，最终可能导致肿瘤的发生。引起抑癌基因失活的 DNA 损伤主要是点突变和缺失等，因此可用点突变的检测技术进行检测。较大的基因缺失的检测可在显微镜下进行染色体分析，微小缺失则可采用印迹杂交技术来鉴定，目前采用 PCR 技术非常简捷，且不需要同位素标记探针，其关键在于引物设计，主要有两种方式： 若缺失 DNA 片段不大，一对引物分别与缺失片 1段两侧顺序互补，在有抗癌基因缺失的肿瘤中，PCR 扩增的靶 DNA 片段减小；若缺失 DNA 片段较大，一
13、对引物设计在缺失片段中，这样在有抑癌基因缺 2失的肿瘤，则无靶 DNA 扩增的产物。（3）残留癌细胞监测中的作用医生想要确证正在治疗的白血病患者体内是否还有恶性细胞存在；对化疗和放疗的癌症病人，确定何时可以停止治疗；在体内重新发现了癌细胞后，又能重新开始治疗。在这些情况下，癌细胞的量非常少，PCR 技术以其敏感性和特异性可为上述要求提供可靠的根据。4）在性别鉴定中的作用利用 PCR 技术鉴定性别在法医学鉴定、运动员性别鉴定、产前诊断中有重要意义。以产前诊断为例，因为遗传的 X-连锁疾病紧影响男性，所以性别鉴定是产前诊断的第一步。男性在 Y 染色体有独一无二的序列，如 3.5kb 的 DYZ1
14、序列在 Y 染色体上有 5000 多个拷贝，用 PCR 技术扩增出 DYZ1 序列上的男性特异的一个 149bp 的片段，就可鉴定为男性。在一个产前性别鉴定实验中，研究人员用微量法从体外受精后的 6 个着床强的人胚胎细胞中个取出一个细胞，每个细胞的 DYZ1 序列利用 PCR 循环 60 圈，有扩增片段的胚胎就是男性胚胎5）在法医鉴定中的应用利用 PCR 技术可从犯罪现场的到的任何少量标本中扩增至少六个卫星 DNA等位片段。标本可包括头发、唾液、精液、血斑和尿等。PCR 大大增加了 DNA指纹图谱法的实用性，为法医学上个体鉴定、亲子认定等提供了可靠的证物。首先用限制性内切酶将 DNA 切成许多
15、长短不一的 DNA 片段，然后在凝胶上通过电压驱动使这些 DNA 片段以不同的速度通过凝胶。这样，DNA 片段在凝胶中就按大小分来了。然后将 DNA 片段从凝胶上转印到尼龙膜上，加入放射性同位素标记的探针（一种已知序列的 DNA 片段） 。探针与尼龙膜上的 DNA 结合，将X 光胶片放在尼龙膜上，就可以显示出带有放射性同位素的的 DNA 片段来。X光片上的条纹就是长短不等的 DNA 片段图谱，看上去就像商品的条形码，称为“DNA 指纹” 。PCR 技术对于 RFLP 方法制作 DNA 指纹图起到了至关重要的作用。犯罪现场留下的往往是蛛丝马迹，有时很难得到足量的纯的 DNA 样品用于 RFLP分
16、析。而号称“基因放大器”的 PCR 技术则使技术人员可以从哪怕一滴血、一根毛发等极少量的样品中扩增出足量的 DNA 分子来然后利用 RFLP 技术来作出DNA 指纹。除通过 RFLP 技术制作 DNA 指纹图外，现在法医还可通过 PCR 直接分析法进行 DNA 分析进而侦破案件。6）在器官移植配型中的应用以骨髓移植为例，HLA_D 抗原在骨髓移植排斥反应中占重要地位，常规混合淋巴细胞培养（MLC）检测。近年来发展了一种更为精确的配型方法：HLA_DNA 限制性片段长度多态性（RFLP）配型。其主要用途是作为常规配型的补充，尤其是 MLC 反应不能给出明确结论时，进行 DNA 配型的分析就显得尤
17、为重要。其次是有些白血病患者难以进行血清学分析，有必要进行 DNA 配型作出最后的判断。但 DNA-RFLP 配型周期长，而且不能分析移植抗原的微多态性。用人工合成的寡核苷酸探针检测 PCR 产物能克服上述两个缺点。目前已成功地扩增了 HLA_Daa、HLA_D 、HLA-D R 等基因，并且应用于移植配型。二、基因克隆在 PCR 技术发明之前，有关核酸研究所涉及的许多制备及分析过程，都是即费力又费时的工作。例如，为了将一种突变基因通其已经做了详细研究鉴定的野生型基因进行比较，首先就必须构建突变体的基因组文库，然后利用有关探针进行杂交筛选等一系列繁琐的步骤，才有可能分离得到所需的克隆。只有在这
18、种情况下，才能对突变基因作核苷酸序列的机构测定并与野生型进行比较分析。然而用 PCR 技术便能在体外快速的分离到突变基因。其主要步骤是根据预先测定的野生型基因的核苷酸序列资料，设计并合成出一对适用的寡核苷酸引物，用来从基因组 DNA 中直接扩增出大量的突变基因 DNA 产物，以供核苷酸序列测定使用。另外也可以根据需要在引物的 5端加上一段特殊的额外序列。按设计要求，在第一次杂交时，引物中的这一段额外序列因无互补性是不能参与杂交作用的，而只是其 3端的部分序列退火到了模板 DNA 的相应部位，在随后的反应过程中，此 5端的额外序列才掺入到了扩增的 DNA 片段上。由于这种加在5端的额外序列可以根
19、据实验者的特定需要而精心设计，因此在实际的研究工作中具有很大的应用价值，提供了很多的灵活性。三、反向 PCR 与染色体步移常规 PCR 的一个局限性是，它需要设计一对界定在靶 DNA 区段两端的扩增引物，因此它只能扩增量引物之间的 DNA 区段。然而有时我们也希望扩增位于靶 DNA 区段之外的两侧未知的 DNA 序列。这就需要应用反向 PCR 技术，它能够有效地满足此种需要，而且对于染色体步移也有实际用途。反向 PCR 的基本操作程序：a、用一种在靶序列上没有切点的核酸内切限制酶消化相对分子质量较大的 DNA；b、产生的不同大小的线性 DNA 片段群体，其中具靶 DNA 区段的 DNA 分分子
20、长度不超过 23kb，经连接后重新环化成环状分子；c、按靶序列设计的一对向外引物与靶序列 5端的互补序列退火结合；d、经 PCR 扩增产生的主要是线性双链 DNA 分子，它是由左侧序列和右侧序列首尾连接而成，其连接点是 a 中所有用的限制酶的识别位点。重复进行反向 PCR 便可用来作染色体步移。但是能被反向 PCR 扩增的 DNA长度是有限的，因此它只能沿染色体分子作较短的步移。四、基因的体外诱变与突变的检测基因的体外诱变是 PCR 技术的又一个重要的研究应用领域。它主要是利用寡核苷酸引物在碱基不完全互不配对的情况下亦能同模板 DNA 退火结合的能力，在设计引物时人为地造成碱基取代、缺失或插入
21、，从而通过 PCR 反应将所需的突变引入靶 DNA 区段。然后将突变基因与野生型基因做功能比较分析，就可以确定所引入的突变的功能效应。这种 PCR 体外诱变技术也称重组 PCR 技术，在检测蛋白质与核酸的相互作用方面具有特殊的价值。PCR 技术不仅可以有效地体外诱发基因突变而且也是检测突变的灵敏手段。已经知道人类的癌症及其他一些遗传疾病是与基因突变有关的。显然，弄清楚突变的性质无论是对于诊断还是治疗都是具有十分重要的意义的。例如，许多癌症都与癌基因 ras 的突变有关，目前已应用 PCR 技术分析了该基因的突变模型及频率。应用 PCR 扩增可迅速的筛选大量的患者样品，具体应用如前文所述。五、基
22、因组的比较研究在 PCR 反应中如果所用的寡核苷酸引物引物太短，那么所得的扩增产物将是一群长短不一的 DNA 片段混合物。这种情况虽对 PCR 扩增的特异性来说是不利的，但在此基础上发展的应用短片段的寡核苷酸引物所作的随机扩增，对于系统发育的研究却是十分有用的技术。重要的一点是用随机引物扩增出来的PCR 产物，经琼脂糖凝胶电泳之后所呈现的带型反映着用作扩增模板 DNA 分子的总体结构特征。如果起始材料用的是细胞的总 DNA，那么扩增的带型便代表着细胞基因组的总体特征。因此，应用随机引物的 PCR 扩增能够测出两个生物体基因组之间的差异。两个物种的个体之间，亲缘关系越接近，其相应的 PCR扩增带型也就越相似反之则差异也就越悬殊。这种技术成为随机扩增多态 DNA分析（random amplified polymorphic DNA,RAPD） 。参考文献1王廷华PCR 理论与技术M 科学出版社 2006.1 1071762孙明基因工程M高等教育出版社 2006.5 1331543黄留玉PCR 最新技术原理方法及应用化学工业出版社M 2005.1 261376
