1、陈燕飞， Ph.D. Field Application Specialist, Bio-Rad Laboratories 第 三代 PCR技术 ddPCR的原理和 医学 应用 ddPCR droplet digital PCR 微滴式数字 PCR 主要内容 ddPCR的基本原理 ddPCR的技术特征 ddPCR的 医学 介绍 （ ddPCR， droplet digital PCR，微滴式数字 PCR） 主要内容 ddPCR的基本原理 （什么是 数字 PCR？什么是 微滴 式数字 PCR / ddPCR? ） PCR技术的 发展历程（ 1983-2015年） 普通 PCR 定性分析 Real
2、-time PCR 间接定量分析 （依赖 Ct或 Cq值，标准品） 数字 PCR 直接定量分析 （无需标准品，绝对定量） 第一代 第二代 第三代 T100 Thermal Cycler CFX96/384 Real-time PCR QX200 Droplet Digital PCR 更灵敏 更准确 更精确 第三代 PCR技术 数字 PCR（ digital PCR, dPCR） 阴性微滴比例推算 起始 靶分子的绝对量 泊松分布 一个 待分析的 PCR反应体系 基本原理： 0或 1的 反应 （ 以 ddPCR为例 ） 成千上万 个 独立的 PCR反应体系 : 靶标 分子 : 背景 分子 有 限
3、稀释 PCR扩增 : 阳性微滴（ 1） : 阴性微滴（ 0） 泊松分布 数字 PCR的核心 思想 1992年数字 PCR思想的提出 利用 有限稀释 ， 终点 PCR和 泊松分布 实现核酸浓度的 绝对定量 The combination of limiting dilution, end-point PCR, and Poisson statistics could yield an absolute measure of nucleic acid concentration. Alec Morley 今天数字 PCR的应用发展 就 像 1990年代末 real-time PCR的发展 （ Na
4、ture Method， 2014） (Jo Vandesompele) PCR技术发展的一种趋势 数据来源 ： GoPubMed， 2016年 6月 11日更新 基于 微滴 的 数字 PCR微滴式数字 PCR（ ddPCR） QX200 AutoDG ddPCR （目前 市场 上 唯一的数字 PCR自动化产品 ） QX200 ddPCR（ QX100 ddPCR的升级版 ，同时 兼容染料法和水解探针法 检测 ） ddPCR的 工作 流程： QX200 ddPCR 手动操作步骤 自 动操作步骤 视频： QX200 ddPCR的 工作 流程 ddPCR的 工作 流程： QX200 AutoDG
5、ddPCR 手动操作步骤 自 动操作步骤 手动操作步骤 自 动操作步骤 视频： QX200 AutoDG ddPCR的 工作 流程 ddPCR的技术特征 （ ddPCR与 real-time PCR等现有技术有什么不同和进步？） Real-time PCR， castPCR， array， NGS， FISH， CE ddPCR vs ddPCR技术特征（一）：微滴化可实现稀有序列的富集 总反应体积 20 L 40,000 个背景核酸（野生型） 40 个靶基因（突变型） 靶基因（突变）丰度 0.1% ddPCR可以实现痕量核酸的高灵敏检测 微滴化分割样品 20,000 1nL 40 个 微滴
6、含 2个背景核酸 19,960 个 微滴 含 2个背景核酸 靶基因 丰度 33% + 1个靶基因 Probe specific assay scheme WT MUT F R 1% mutant 0.01% mutant 0.1% mutant 0.005% mutant 0% mutant (wildtype only) 0.001% mutant 高含量野生型 DNA背景下 BRAF V600E稀有突变的 ddPCR检测 （ Anal Chem 83, 8604） （ DNA定量分析 / 肿瘤突变分析 / 基因分型） ddPCR技术特征 （一） ：微滴化可实现稀有序列的富集 ddPCR的技
7、术特征 （二） ：优秀 的 准确度、精密度和重复性 （ by 中国计量科学院） （ DNA定量分析、绝对定量） Precision Independently Verified and Observed, +/- 1.5% Uncertainty Over Theoretical Value Gravimetric Experiments Conducted at National Measurement Institute, NSW (Australia) （ by 澳大利亚国家计量院） （ DNA定量分析、绝对定量） （肿瘤相关 microRNA定量分析、方法学对比） ddPCR的技术特征
8、 （二） ：优秀 的 准确度、精密度和重复性 ddPCR的技术特征（三）：对 PCR抑制剂的容忍度更高 背景 ：验证抑制剂对 ddPCR反应结果的影响 方法 ：采用经验证的 CMV qPCR体系对 UL123和 UL55进行扩增 ， 并加入 SDS、 EDTA和肝素作为抑制剂 （ DNA定量分析 / 病毒检测 / 临床 复杂样本 的检测） ddPCR的技术优势 成功应用的起点 能够 检测含量极低的核酸序列 灵敏度可达单个核酸分子 ， 检测限低至 0.001%， 原因在于 微滴化 步骤可以实现靶标 DNA/RNA的 富集 无需标准品 （ 标准曲线 ） ， 即可对靶分子起始量进行 绝对定量 特别
9、适合基质复杂样品的检测 终点 PCR检测 ， 不依赖 Ct值 ， 不依赖扩增效率 ， 能克服 PCR抑制剂的影响 ；适合 动血样 、 FFPE组织 、 粪便 、 尿 液 、 痰液 、 水样 、 土壤 、植物等复杂样品中 DNA的绝对 定量 能够有效 区分浓度差异 （ 变化 ） 微小的样品 更好的准确度 、 精密度和 重复性 ， 可以用于精确测定靶 基因的相对表达 ， 基因拷贝数变异分析 等 ddPCR的医学应用介绍 （基于已发表文献） （被验证、 可重复、有 创新性的案例） (应用文献仅限英文研究性文章，不含综述、图书等 ) ddPCR的应用文献 （ 1） 总体研究水平 较高； （ 2） 按年
10、呈倍数增加 基于文献的 ddPCR应用介绍 应用文献情况统计 ddPCR的最新应用分类 研究思路参考 ddPCR的应用介绍（ 1） 痕量核酸检测 痕量核酸 检测 稀有序列检测 (RSD) （待测序列与背景核酸 不相似 ） 病原微生物检测 环境和分子生态 转基因分析 稀有突变检测 (RMD) （待测序列与背景核酸（野生型DNA） 高度相似 ） 肿瘤突变检测 产前诊断 器官移植 痕 量核酸检测相关方法比较 Method Sensitivity Nb of Targets Throughput Cost Abs. Quant qPCR + + + Low + CAST-PCR + + + High
11、NA Sanger/CE + + + Low NA NGS + + + Very High NA ddPCR + + + Moderate + ddPCR尤其适合： 对 灵敏度 要求非常高的核酸痕量分析研究 基质复杂样品 中的核酸准确定量 （ 如组织 、 体液 、 排泄物 、 土壤、 水 环境等 样品 ） 难题 : EGFR突变的肺癌治疗过程中的 肿瘤活检采样 是一项很有挑战性的工作 ， 越早的突变检查越有利于治疗 对策 : ddPCR可以 EGFR突变 的 肺癌患者 的 血浆中游离 DNA（ cfDNA ） 为样本 ，检测与 EGFR敏感性和药物抗性相关的突变 ddPCR assays fo
12、r EGFR, KRAS, BRAF mutations were developed using plasma collected from patients with advanced lung cancer or melanoma of a known genotype. 案例 1： 肿瘤 相关血浆中的 cfDNA稀有序列检测（无创检测） Key Findings: Plasma levels of mutant EGFR in 9 patients receiving first-line erlotinib until objective disease progression (P
13、D) ddPCR of cfDNA allows highly specific all 3 had indolent progression in chest only. 案例 1： 肿瘤 相关血浆中的 cfDNA稀有序列检测（无创检测） 案例 2： 肝癌患者体内乙肝病毒 HBV 的拷贝数检测 通讯作者：武汉大学中南医院 医学 科学研究中心刘松梅老师 研究内容： 探索 HBV血清学 和 ddPCR检测结果与肝 细胞 癌（ HCC） 临床 分期和病症之间的关系 技术 突破 ： ddPCR成功 的克服了 real-time PCR在检测 FFPE处理的肝癌患者组织样品中 HBV DNA时 ，遇到
14、的 准确度、灵敏度和重复性 不足的 缺点 实验结论 ： 1、 ddPCR的 灵敏度和 准确度 比 real-time PCR更高 131个待测样品中 HBV DNA浓度范围为 1.1175.5 copies/ul； 2、 即使是 在 24个 血清学检测呈阴性 的 样本中也检测到了痕量的 HBV DNA； 3、 样品中 HBV DNA的含量与肝细胞癌 （ HCC） 组织的 临床分期 一致（ tumor-nodes-metastasis (P=0.008) ， Barcelona-Clinic Liver Cancer (P= 0.045)） ； 4、 ddPCR技术可以用于 肝癌的早期无创诊断 ， 病程监控 ， 肝移植 、 化疗或免疫抑制的疗效评估 。 （通讯单位：武汉大学中南医院） 案例 2： 肝癌患者体内乙肝病毒 HBV 的拷贝数检测 生化危机与拯救人类
