1、应用 PVA 构建妊娠相关血浆蛋白 A 固相时间分辨荧光免疫试剂应用 PVA 构建妊娠相关血浆蛋白 A 固相时间分辨荧光免疫试剂 摘要 目的：合成(SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 复合物，并用于构建妊娠相关血浆蛋白 A 固相时间分辨免疫荧光试剂。方法：用PVA 作为载体结合 BCPDA Eu3 和生物素 亲和素，以双抗体夹心法原理，结合生物素标记抗体和包被抗体建立 PAPP A 时间分辨免疫荧光试剂，并进行方法学评价。结果：成功的合成了活性的(SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 复合物，构建 PAPP A 试剂检测灵敏度为 0.7 mIU/L；批
2、内变异系数在 3.89%4.96%之间,批间变异系数在 7.35%9.27% 之间。结论：合成的(SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 复合物较高的反应活性，可以用于多种试剂的构建。构建的PAPP A 试剂灵敏度高，具有潜在的 临床应用价值。 关键词 妊娠相关血浆蛋白 A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素生物素聚乙烯胺4,7 二氯磺苯基 1 ，10 啡罗啉 2 ，9 二羧酸铕复合物；唐氏综合征 Develop A Direct Solid Phase Lanthane Time resolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPP Autiliz
3、ing PVA Abstract :Objective To develop a direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassayreagent of PAPP A by synthesizing a complex of (SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 . Methods Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotin streptavidin and europium chelate of 4,7 bis(chlorosulfophenyl) 1,10
4、 phenanthroline 2,9 dicarboxylic acid(BCPDA). Using labeled PVA complex,We designed two site sandwich time resolved fluoroimmunoassay of PAPP A and evaluated assay characteristics of PAPP A kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 and a reagent of PAPP A.
5、Detection limits achieved were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 0 10000mIU/L.Intra and interassay imprecision (CV) was 3.89% 4.96% and 7.35% 9.27%.Recovery was 95.8% 104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of
6、kit could be synthesized ,taking advantage of it. The reagent of PAPP A was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity. Key words: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay; Streptavidin biotin Polyvinylamine euro
7、pium chelate of 4,7 bis(chlorosulfophenyl) 1,10 phenanthroline 2,9 dicarboxylic acid; Downs Syndrome 妊娠相关血浆蛋白 A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPP A)是一种高分子 2 糖蛋白，20 世纪 70 年代在孕妇血清中被发现1。在孕妇血中主要 PAPP A 是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为 200 000250 000亚基构成。PAPP A 亚 基和两个嗜红细胞主要基础蛋白(Proform of eosinophil
8、 major basic protein)以二硫键结合而成2，在孕妇血中只存在微量游离单体 PAPP A。PAPP A 亚基由 1 547 个多聚核苷酸构成，包括 1 个拉长的锌指结构，3 个 Linnotch 重复序列，以及 5 个短一致重复序列3。在体内 PAPP A 是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白 4(IGFBP 4)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP 5)起作用。胰岛素样生长因子 I(IGF I)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主要通过 IGF 1 受体起作用，IGF I 、II 的生物活性受 6 个高亲和性 IDFBP 调节4，5。PAPP A 主要用于产前筛
9、查唐氏综合征(Down s Syndrome，DS)，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止 DS 儿的出生，但目前开展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有 1%3% 的流产率,且方法繁琐,出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为 PAPP A 可作为 DS 胎儿产前筛查的的标志物。在 15 周20 周通过结合孕妇孕周、超声诊断和Free HCG 可以鉴别 65%75%，但要在 3 个月6 个月结合 AFP、游离 E3 以及抑制素上述成分可鉴别 85%90% 6。有文献7报道PAPP A 在急性冠状动脉综合征(ACS) 的早
10、期诊断有一定的意义，PAPP A 在 ACS 患者血清含量30 mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的 PAPP A 且存在动态变化，必 须利用超灵敏的方法进行检测。国内 PAPP A 的诊断试剂大多为 ELISA 和 PerkinElmer 公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫分析(dissociated enhance lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DELFIA)试剂，无国产 PAPP A 时间分辨荧光试剂。我们利用 PVA(聚乙烯胺)作为载体结合 BCPDA 镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析(direct solid ph
11、ase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)试剂。为提高检测灵敏度和克服 BCPDA 标记抗体使抗体失活的 问题，我们引入了生物素 亲和素(biotin streptavidin system)系统。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 4,7 二氯磺苯基 1 ，10 啡罗啉 2 ，9 二羧酸4,7 bis(chlorosulfophenyl) 1,10 phenanthroline 2,9 dicarboxylic acid,BCPDA 自制；纯化亲和素(Streptavidin， SA ，Sigma 公司)；硫代琥珀酰
12、亚氨 6 生物素氨基 己酯类Sulfosuccinimidyl 6 (biotinamido) 6 hexanamido hexanoate，Sulfo NHS LC LC Biotin， pierce Chemical Company；聚乙烯胺氢氯化物(Polyvinylamine hydrochloride， PVA,Chemical Dynamics Corp) ；硼酸 钠、二甲 亚砜( 天津化学试剂有限公司) ；单克隆抗体根据文献5选择 Hyb2345(Statens serum Institut)作为检测抗体，mAb 10E1(HyTest Oy，Finland)作为捕获抗体；PAP
13、P A 标准品和质控品购于 PE 公司(质控血清：Control1 508 mIU/L，Control2 2 325 mIU/L，Control3 为 4 952mIU/L)；鼠 IgG(晶美公司) 。 1.1.2 仪器 Wallac 1420 多标记计数仪(Wallac OY，Finland )；HPLC 硅柱TSK 250 尺寸排阻柱( BIO RAD 公司) ；96 白色微孔板( NUNC 公司)、亲和素包被板(Innotrac Diagnostics Oy 公司) ；Amicon 可浓缩离心管(Amicon microconcentration units ，MW 30 000 Cut
14、 off) 1.2 方法 1.2.1 BCPDA 的制备 参见文献详细步骤810。 1.2.2 生物素聚乙烯胺 BCPDA (Bio)x PVA (BCPDA)y复合物的构建11 用 0.5 M 的碳酸盐(pH 9.1)缓冲液配制浓度为 10 mg/ml 聚乙烯胺(PVA)溶液 ，将 200 g NHS LC LC Biotin 溶于 20 l 碳酸盐缓冲液中，取 200 l 上述 PVA 溶液加入 20 l 上述 NHS LCLC Biotin溶液中，振荡混匀，室温反应 1.5 h(PVABio=115)，用 0.5 M 碳酸盐缓冲液将混合液稀释到 1 ml，将固体 BCPDA 研磨成粉末状
15、，先在上述 1 ml 混合液中加入 5 mg BCPDA，用力 搅拌，直到溶解，重复加 3次 BCPDA，5 mg/次，共计 20 mg BCPDA，在室温放置 5 h6 h，直到溶液澄清，转移到透析袋中，用 0.1 M NaHCO3 5 L 透析、 过夜、重复透析 2 次，尽可能除去没反应的 BCPDA 和生物素。 1.2.3 HPLC纯化(Bio)x PVA (BCPDA)y 复合物 离心浓缩上述(Bio)x PVA (BCPDA)y 复合物到 0.3 ml0.5 ml(用 Amicon microconcentration units ，MW 30 000 Cut off)。流动相 0.
16、05 M Tris缓冲液(pH 7.70)，控制 HPLC 流速 0.8 ml/min，在 325 nm 处监测层析液(325 nm 为 BCPDA 最大吸收峰)，上样后，马上收集，(Bio)x PVA (BCPDA)y 在 10 管16 管约 5 ml 左右，取 10 l(Bio)x PVA (BCPDA)y 层析液加入 90 l 水滴入亲和素包被板微孔中，温育 30 min，洗板，加入用 Tris 缓冲液配制的 10 M5 M EuCl3 100 l，反应 10 min，洗板、干燥，用 Wallac 1420 检测 Eu3 的荧光强度，没结合复合物的被洗去了，没结合 BCPDA 的复合物因
17、无法结合 Eu3 而没有荧光，计算标记的 PVA，大约每分子结合 50 个100 个BCPDA 分子。 1.2.4 构建亲和素 生物素 PVA BCPDA (SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 复合物11 用 0.1M Tris 缓冲液(pH 7.8)配制小牛血清白蛋白(BSA 溶液)60 g/L，同时加入 EuCl3，使Eu3 浓 度为 10-6 mol/ml，用双蒸水配制 亲和素溶液浓度为 1 mg/ml，取上述 BSA 溶液 1 ml，加入 10 l 亲和素溶液，再加入 50 l 的(Bio)x PVA (BCPDA)y 复合物(通过固相免疫分析，棋盘滴定法确定最佳
18、用量比，步骤略， 结果见后)，混匀，55 温育 1.5 h，4 保存备用。 1.2.5 (SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 复合物反应活性 用生物素化的各种浓度(0 ng/50l，0.5 ng/50l，5 ng/50l，50 ng/50l，100 ng/50l)鼠 IgG 包被 96 孔微板(同第 7 步)，用 60 g/L BSA 和 0.1 mol/L Tris 缓冲液(pH 7.8)10 倍稀释(SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 复合物，在板的微孔中加入 100 l 稀释后的(SA)z (Bio)x PVA (BCPDA)y Eu3 复合物
19、，室温反 应 30 min，洗板、干燥， 测量荧光强度(cpm)。本 实验是验证复合物的反应活性。 1.2.6 生物素标记 10E1 抗体12 用二甲亚砜制备 硫代琥珀酰亚氨 6 生物素氨基 乙酯溶液(10 mg/ml)，将抗体 10E1 溶于 0.1 mol/L 硼酸钠溶液(pH 8.8)，每 1 mg 抗体中加硫代琥珀酰亚 氨 6 生物素氨基 己酯类溶液 210 g 混合，室温放置 4 h，在上述溶液中加入 20 ml 1 mol/L NH4Cl，室温反应 10 min，将反应液进行透析，除去未结合的生物素，将抗体浓度用分析缓冲液配置成 8 ng/l，-20 保存备用。 1.2.7 单克隆 Hyb2345 抗体包被 96 孔微滴定板 将抗体溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液(pH 4.9)，配置成 5 g/ml 抗体溶液，在每一孔中加入 80 l抗体溶液，室温反应 20 h，然后用生理 盐水洗 3 次，然后每孔加 120 l 0.05 M Tris Hcl 缓冲液(pH 7.4 含 0.9%生理盐水、0.05% NaN3、0.5%小牛血清白蛋白 BSA)浸泡 2 h。吸干缓冲液，干燥，密封4保存。 1.2.8 样本收集、定标、灵敏度、精密度和回收实验分析过程 选取怀孕 8 周、9 周、11 周妇女血清各一份，经 PE 公司的DELFIA 试剂和 D
