1、杀猪流程：（6 月 21 日晚上 11 点 30 开始杀猪） 实验动物：PCV2、PRRSV 抗原抗体双阴性断奶仔猪 3 头； 实验器材：解剖刀柄（1） 、解剖刀片（3 ） 、大剪刀（1） 、塑胶手套（ 1 盒） 、大搪瓷盘（1） 、酒精棉球（2 瓶） ； 消毒止血钳（3） 、灭菌大培养皿（ 3） 实验过程：三点半点到实验室准备实验用具（细胞房中器材） 。八点开始，前腔动脉放血处死仔猪，将前肢、后肢与躯干连接的皮肤和肌肉分离，沿腹中线将皮肤划开，小心分离脾脏；向上划开胸部皮肤，将皮肤和肌肉沿肋骨分离到肋骨末端，用手轻轻拍打一侧肋骨，使肺脏向背心侧脱落，小心剪开最后肋骨（切勿损伤到肺） ，再次拍
2、打，使肺脏彻底脱离，用剪刀向上剪开肋骨或用解剖刀划开，在颈部用解剖刀小心分离气管，分离开后用消毒的止血钳完全夹住气管，在其上方 5mm 处划开气管（防止病原进入） ，渐渐轻轻分离肺脏与背部脊柱相连的部位。划断食管、韧带等阻碍物，将肺脏与心脏一起取下，放入灭菌培养皿中，用酒精棉球擦拭肺脏表面，同时将血管中血液尽可能排放干净，用培养皿承装进入细胞房，准备下一步操作； 该过程大概需要 1.5 小时；（三头猪） 冲肺收集肺泡巨噬细胞步骤：（6 月 22 日晚上九点开始进行） 实验准备过程及器材：五点到实验室，将细胞房、超净台打开紫外灯光照射，并事先清理超净台台面，将应用实验器材全部移到细胞房内紫外消毒
3、。分别有： 超净台内：消毒剪刀（1） 、10ml 玻璃刻度吸管（3 ） 、灭菌纱布（1 盒） 、三角瓶（3） 、打火机（1） 、大吸头（1 洗耳球） 、小胶头滴管（2） 、5ml 刻度吸管（1 管） 、巴士吸管（1 管） 、2mlEP 管（2 个） 、垃圾篓（1） 、酒精棉球（1 ） 、1ml 枪及枪头（1） 、200 l 枪及枪头（1 ） 、玻璃纸（高压过） 、 水浴锅内：DPBS（5 瓶） 、PBS （2 瓶） 、红细胞裂解液（ 1 瓶） 桌面上：泡有多聚赖氨酸的盖玻片（24 片） （配套消毒小镊子） 、六孔板（6 块） 、50ml 塑料离心管（30 个） 、95%酒精（2 瓶） 、75%
4、 酒精（两瓶） 、烧杯内放无水乙醇的细胞计数板（两块） 、酒精喷壶（2） 、乳胶手套（2 ） 、垃圾袋（10 只） 、口罩（4 只） 、塑料手套（1） 、 冰箱内：1640 营养液（加双抗和胎牛血清） （2 瓶） 、胰酶（ 5 管分装好的） 、台盼蓝染液（0.4%） 、 病毒应在晚上 12 点用单蒸水冲开（注意密封） 实验过程：1、完整收取肺脏，止血钳夹持住气管（密闭） ，酒精擦拭干净放血完全后进入细胞房； 2、用止血钳夹住肺气管侧壁，剪刀剪开一个端口，同时用止血钳夹住端口稍下 2ml，用10ml 玻璃刻度吸管向肺脏灌 DPBS，150ml，轻轻揉捏 5min，使肺泡充分打开；（千万注意不要多
5、灌，500ml 一只肺是最多的） ； 3、将灌洗液倾入瓶口覆有无菌双层纱布的三角瓶中，注意事先用一块纱布包住血管口，严防血液灌入三角瓶；（） 4、反复两次到三次，重复步骤三，尽量使肺泡巨噬细胞冲出； 5、将灌洗液分装到50ml 离心管中，1500rpm，10 分钟，4 度离心； 6、DPBS 洗涤细胞，重复步骤 5； 7、将数个管内细胞重悬到 2-4 管内，重复步骤 6； 8、如果上清液中红色明显（红细胞较多） ，则加红细胞裂解液，按红细胞裂解液：DPBS=3:2 的比例处理，在 37 恒温箱中作用 20-30 分钟，再次离心；（尽量不要用红细胞裂解液，因为损伤实在太大。 ） 9、重悬到 1
6、管内，1640 培养液（加血清和双抗） 10-20ml 重悬，离心； 10、加 20ml1640 培养液重悬细胞（按 10ml/头，充分重悬，否则会造成细胞成团块状，死亡率太高） ；准备细胞计数。 注意：DPBS 包括冲肺的步骤，最多洗涤三次，再多细胞就会损失过多。 细胞计数步骤： 实验器材：200L 的枪（1） 、200L 枪头盒（1） 、1mL 枪（1） 、1mL 的枪头（1） 、2mL的 EP 管（1） 、细胞计数板（ 1） 、计数器（1 ） 、显微镜、U 盘 台盼蓝染液（浓度 0.4%使用时 10倍稀释） 、 实验操作：1、吸 950L 的 DPBS，50L 的细胞悬液，再吸取 100
7、L 的台盼蓝染液，充分混匀，显微镜下计数； 2、计数时在密集的分界线四角，取四个大格（16 个小格）计数，四个角分别测定，计左不计右，计上不计下，计数完毕平均一下即可。50L 的悬液总细胞数为：X*20*104 个，20ml 的则为 4X*106个。 将细胞稀释后铺板。稀释到 107 个（）放细胞瓶和六孔板的密度相同 计数一定要学会。铺细胞板步骤： 实验器材：细胞培养瓶（20 块） 、5ml 刻度吸管（1 管） 、小吸球（1） 、1640 培养液（加双抗和血清） 、 实验步骤：1、加 1640 培养液将细胞悬液 10 倍稀释； 2、铺细胞板，每瓶加 10ml 稀释液，标记，如 2012.06.
8、23 对照组 0h； 3、复苏 2-6h，加红细胞裂解液的话，复苏时间适当延长，不加的话复苏时间可短，基本4h 比较合适； 铺六孔板步骤： 实验器材：玻璃纸、六孔板、1ml 枪及枪头、消毒镊子、 实验准备：事先将盖玻片泡在多聚赖氨酸中，在铺六孔板前 1h，将盖玻片取出，放在高压好的玻璃纸上，自然干燥； 1、铺六孔板，与细胞瓶浓度相同，每孔加 2ml； 2、铺时先将一滴滴加到六孔板正中，轻压一下，然后将盖玻片盖在悬液上，滴入 2ml 稀释液 37恒温箱中复苏 2-6 小时； 六孔板共四块，每块 12ml，一共需要 48ml，即 50ml 左右；优先取。 等待复苏后，准备收细胞，并做细胞爬片。 收
9、肺泡巨噬细胞步骤： 实验准备：等待复苏的时间内，配好加有双抗和血清的 1640 营养液准备换液；准备好胰酶（提前解冻一小时才能使用） ；巴士吸管照射紫外光，准备 1.5ml 的 EP 管；病毒密封好在自来水中解冻（20ml）足够； 实验器材：1640 营养液、胰酶、 10ml 玻璃离心管、10ml 玻璃离心管盖、PBS （1 瓶） 、病毒（10ml） 、1.5ml 的 EP 管、封口膜 实验操作：1、首先观察细胞形态，在显微镜下观察细胞贴壁情况、成活率； 2、所有时间点一起更换营养液，攻毒组和对照组加相应量病毒和 PBS，细胞培养瓶中每瓶加 500L，六孔板每孔加 200L； 3、加病毒后 3
10、7 度作用 30min；加培养液 10ml； 4、取出培养瓶，倾倒掉培养液，PBS2ml 洗两次； 5、加入 1.5ml 胰酶处理，作用 5-10ml， ； 6、加入 5ml1640 培养液，用巴士吸管吹散细胞（ 100 下作用）尽量不要冲出气泡，否则细胞损失会过多； 7、倒入 10ml 玻璃离心管，配平， 3000rpm 离心 5min； 8、倾倒上清液，用 PBS3-4ml 重悬，转入 EP 管，3000rpm，5min ，弃上清液；（可重复一次） ； 9、封口膜封口，将 EP 管投入液氮中。 做细胞爬片步骤： 实验准备：分为开始铺六孔板和开始做爬片两种。铺六孔板前：事先在做爬片前先准备好
11、盖玻片，铺片前一小时泡在多聚赖氨酸中处理，取出来用无菌镊子夹住烤干一下；放在无菌玻璃纸上；准备好六孔板 4 块；准备好较好的 PBS（2 瓶） ；开始做爬片前：准备好全部用筐子盛起来。无水乙醇、一抗（按 1:200 稀释） 、二抗（按 1:200 稀释） 、triton-100（按 1:100 稀释）以及DAPI 染液（按 1:10000 稀释） （可在 0-6 小时等待间隙配制）等溶液（用饭盒或白瓷盘装） ；准备好废液缸、塑料手套、塑胶手套、口罩、蓝枪头 2 盒、计时器 1 个、黄枪头 1 盒、白枪头 1盒、PBS2 瓶、100%乙醇配制的酒精棉球，酒精喷壶（100%酒精配制） 实验器材：铺
12、板：盖玻片、玻璃纸、无菌小培养皿（多聚赖氨酸） 、小镊子、弯头注射器；六孔板、蓝枪头盒、大枪、PBS、酒精棉球；口罩、手套、喷壶、记号笔、白胶布、 爬片（攻毒）：病毒（事先冲开） 、1640 营养液、100L 的枪、黄枪头、计时器 爬片（染色）：无水乙醇、一抗（按 1:200 稀释） 、二抗（按 1:200 稀释） 、triton-100（按 1:100 稀释）以及 DAPI 染液（按 1:10000 稀释） （可在 0-6 小时等待间隙配制）等溶液（用饭盒或白瓷盘装） ；准备好废液缸、塑料手套、塑胶手套、口罩、蓝枪头 2 盒、计时器 1 个、黄枪头 1 盒、白枪头1 盒、PBS2 瓶、 10
13、0%乙醇配制的酒精棉球，酒精喷壶（ 100%酒精配制） 实验步骤：一、铺板时：1、事先准备好应用物品； 2、先滴加 1 滴稀释液到六孔板，盖上盖玻片，用镊子压紧一下，再滴入约 2ml 稀释液； 3、37 度恒温复苏 2-6 小时； 4、时间到后，先将老的培养液弃掉，攻毒，每孔 200L，对照、单染、双染各取两个平行；然后将其放在 37 度恒温箱中作用 30min，取出； 5、加入新的培养基，开始计时，0 小时不要，6、12、24、48 小时分别取出；（做好标记，切记切记） 二、爬片时：1、取出细胞爬片，首先观察细胞形态和贴壁细胞数量，轻轻将培养液吸掉，2mlPBS 洗涤三次，千万不要冲到细胞上
14、，沿六孔板孔壁缓缓流下，轻微震荡作用十分钟，轻轻吸出，如是三次； 2、加入 -20 度预冷的无水乙醇约 1ml，室温下作用 10 分钟以上（可控速） ，固定；重复步骤一； 3、加入 0.3%的 tritox-100 1-2ml，通透细胞膜；配制时用 PBS 配制。室温下避光通透 15 分钟，重复步骤一； 4、加入一抗，阳性血清 200 倍稀释，每孔加 500L（要能够铺满盖玻片） ，37 度避光作用 1h，孵育；重复步骤一； 5、加入荧光二抗（FITC）200 倍稀释，每孔加 500L,37 度避光孵育 30min，重复步骤一； 6、加入 DAPI 核染料，按 1:10000 稀释，每孔 50
15、0L，作用 10 分钟，重复步骤一；7、放在荧光显微镜下观察。 三、观察：载玻片先泡一段时间的酸？事先准备好湿盒（内放三蒸水吸水纸） 、小镊子、弯头注射器、八片处理过的载玻片（酒精泡过） 、搪瓷盘（大，装的比较多，放六孔板） ，千万注意：细胞是生长在六孔板表面的，盖的时候一定要将细胞贴住载玻片放置。拍照，处理，取照片，及时速度。猪肺泡巨噬细胞的培养（图）关键词： 猪肺泡巨噬细胞 细胞培养 2008-08-19 00:00 来源：互联网 点击次数：31941、细胞培养所用溶液及其配制1RPMI1640 及：按照产品说明配制，过滤除菌，4保存备用。新生牛血清：56灭活 30min，-20保存备用。
16、2104U/ml 青、链霉素液（双抗）：青链霉素各 2106 U 溶于 100ml 灭菌双蒸水中，过滤除菌，分装，-20保存备用。10Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4.12H2O 2.89g，KH2PO4 0.2g，1%酚红溶液 1.5ml，胰酶（1:250 ）2.5g ，溶于100ml 双蒸水中，NaOH 调节 pH 至 7.27.5，过滤除菌，分装，-20保存备用，使用时110 倍稀释。7.5%NaHCO3： 7.5g NaHCO3 溶于 100ml 双蒸水中，115高压灭菌 15min，置 4冰箱冷藏备
17、用。10% RPMI1640 营养液：于 1RPMI1640 溶液中加入 10%小牛血清，按照 1% 比例加入2104U/ml 双抗，用 7.5% NaHCO3 或 10% HCl 溶液调节 pH 值至 7.27.4。2、将 50 日龄的 SPF 仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用 0.9%的生理盐水洗涤外表面，将 pH7.2 的 PBS30.0ml 从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面， 12min 后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，用单层无菌 100 目不锈钢筛过滤，收集全部灌洗液，2000r/min 离心 10min，收集沉淀。洗涤两次后加入适量含 10%胎牛血清的 1RPMI1640 营养液吹散细胞，置培养瓶或培养皿中于 37C CO2 培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞继续用含 10%胎牛血清的1RPMI1640 培养液培养备用。
