1、动物生物化学实验一、 动物生物化学实验特点1 实验材料新鲜 2 被测成分在动物组织、细胞中含量很少 3 体外操作应尽量模拟生理环境条件 4 在绝大多数条件下，生物分子是溶解在溶液中，很难直接看到所研究的内容二、 注意事项1. 工作服；严禁吸烟、饮水、进食；废液缸、冲稀、废物桶2. 铬酸洗液；10%-20%尿素；硝酸3. 恰当的吸管，减少误差三、 离心机1 利用离心力把溶液中比重不同的固液分离。分为常速、高速和超速离心机。2 液体要加到三分之二左右、严格配平、不要超过最大转速、防止过热。四、 酶活性的观察1 酶：活细胞产生，对特异底物有高效催化能力的生物催化剂，化学本质多数蛋白质。影响酶活性：P
2、H、温度、激活剂和抑制剂激活剂、抑制剂：能（升高）降低酶的活性，但又不使酶失活的物质对酶有选择性（区别于酶的失活）2 淀粉在唾液淀粉酶的催化下会水解，水解程度随时间的延长而增加。利用碘液指示水解程度：淀粉（蓝色）糊精（深褐色、深红色）麦芽糖、葡萄糖（棕黄色，碘液本身的颜色） 3 37 摄氏度、PH6.8（磷酸缓冲液中 PH6.6） 、激活剂 0.5%NaCl、抑制剂 1%CuSO44 注意：温度对酶的影响中沸水浴后要冷却；酶反应的特异性检验中加斑氏试剂后沸水浴先砖红色沉淀；酶的活性通常是以测定酶作用的底物或产物在酶作用前后的变化来进行观察。五、 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察1 琥珀酸
3、脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，位于线粒体中，可使琥珀酸脱氢而生成延胡索酸。在缺氧的条件下，适当的受氢体也可接受脱氢酶从底物上脱下的氢。当甲烯蓝（蓝色）作为受氢体甲烯蓝被脱下的氢还原成甲稀白（无色物质） 。 【甲稀白易氧化用液体石蜡液封】2 酶的竞争性抑制作用：丙二酸化学结构与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争性的结合琥珀酸脱氢酶的活性中心，若已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，此现象称为酶的竞争性抑制作用。解除酶的竞争性抑制作用：加大底物浓度的方法3 研磨应充分；滴加试剂时，最后滴加心脏制备液。六、 肝糖原的提取与鉴定1 糖原微溶于水，无还原性，遇碘呈红色。提取时，肝中的蛋白质被三氯乙酸沉淀
4、，离心后弃沉淀，向上清液加入乙醇则肝糖原被沉淀，溶于水即可。2 糖原遇 HCl 水解后生成葡萄糖，具有还原性，调节 PH 至中性后，可与斑氏试剂沸水浴生成砖红色沉淀。3 注意：若处于饥饿状态，肝糖原含量会大量减少；肝脏离体后，肝糖原会迅速分解，需用三氯乙酸使相关酶失活；PH 过高会影响（蓝色多？）七、 血液葡萄糖的测定1 葡萄糖醛基具有还原性，与碱性铜混合加热醛基被氧化成羧基，生成砖红色氧化亚铜。2 氧化亚铜可使磷钼酸还原成钼蓝（蓝色） 。蓝色的深浅与血滤液中的糖浓度成正比，通过与标准管比色，可求出测定管葡萄糖的含量。3 福林吴宪氏法：福林-吴宪血糖管（用前不用刷洗，保持内壁干燥） ，管径在
5、4ml 容量处缩小，可减少在煮沸时管内液体与空气的接触，以避免产生的氧化亚铜再氧化（降低实验结果）4 分光光度计：公式：使用 预热仪器 20min；选定波长；调节透光度“0”点（开盖调“0” ）闭盖调“100” ，将空白溶液的比色皿加入第一格，blabla；测定吸光度；关机注意：防止光电管疲劳，不用时将比色皿暗箱盖打开；不准碰比色皿透光面，捏毛玻璃面；待测液润洗5 注意：滴加磷钼酸后静置为放出 CO2 ；在 620nm 处比色；沸水浴时准确加热 8min；磷钼酸后显色不稳定，应迅速比色；血滤液内除葡萄糖外还含其他还原性物质,故测的结果较实际值偏高八、 血清总蛋白及非蛋白氮的测定1 总氮：所有含
6、氮物质中氮的总和；非蛋白氮：除蛋白质以外的含氮物质2 非蛋白氮经强酸消化后转变为硫酸铵，加入奈氏试剂后呈现棕黄色，波长 420nm 处比色3 钨酸是蛋白质沉淀剂4 加入奈氏试剂后变浑浊：奈氏试剂酸碱度不够精准；消化时加热不足；显色后至比色时间过久；血滤液内非蛋白氮含量过高九、 动物组织核酸的提取与鉴定1 加入水饱和酚剧烈震荡，蛋白质在中层，取上清液加乙醇留沉淀溶于水。加硫酸沸水浴水解2 现象：磷酸：加钼酸铵生成磷钼酸被氨基苯磺酸还原成钼蓝嘌呤碱：与硝酸银生成灰褐色絮状嘌呤银化合物核糖：与硫酸生成糠醛与 3,5-二羟甲苯生成绿色化合物脱氧核糖：与二苯胺生成蓝色化合物十、 聚丙烯酰胺凝胶电泳1 聚
7、丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵或核黄素和加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。2 光化学作用：核黄素化学聚合作用：过硫酸铵+TEMED（加速剂）3 连续系统：一种浓度凝胶、一种 PH 和一种缓冲剂成分组成不连续系统：两种不同浓度凝胶组成体系4 本实验是不连续系统由浓缩胶和分离胶组成。浓缩胶：位于上部、孔径大（无分子筛效应） 、缓冲液 PH6.7tris-hcl、浓缩作用分离胶：下部、孔径小、缓冲液 PH8.9 tris-HCL5 不连续系统：电位梯度-三种物理效应：浓缩效应、分子筛效应、电荷效应6 蛋白质从负极到正
8、极；快离子：圆、小、表面电荷多7 注意：考马斯亮蓝染色；丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺神经毒性；边插入针管边脱水，使针头沿管壁转动，吸耳球吹出；管要水平；圆盘电泳；溴酚蓝水溶液+血清点样十一、 血清 IgG 的分离制备1 盐溶：在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐（适当增加盐浓度） ，增加蛋白质分子的电荷，增强蛋白质与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大；盐析：当盐浓度继续增加到某一浓度时，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质不溶而析出。 （不同蛋白所需盐浓度不同，最小盐量成为盐析浓度）2 PH=PI 等电点；PHPI 负电；PHPI 正电3 盐析法：通过控制盐的浓度，使蛋
9、白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，从而分离目的蛋白（影响因素：PH、蛋白质浓度、离子强度和类型、温度）4 硫酸铵：优点：化学性质稳定；溶解度大；溶解度随温度变化小；廉价；性质温和，不影响蛋白质的生物活性。缺点：偏酸；含金属离子（铅） ，需用 EDTA 螯合5 注意：加饱和硫酸铵时要慢，边加边搅拌，尽量不要产生泡沫；取得是下沉淀；十二、 凝胶柱层析法（其他的层析方法也要）1 凝胶过滤层析法（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据他们分子大小不同而进行分离的技术。层析柱中的填料是某些惰性的球形多孔性凝胶颗粒，多是交联的聚糖类物质如葡聚糖或琼脂糖。2 原理：凝胶颗粒
10、内部是具有多孔网状结构，形成很多空穴，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，他们经历的流程短流速快，最先被洗脱；比凝胶孔径小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的流程较长，移动速度较慢，洗脱出来所需要的时间就长，故最后被洗脱出来（分子筛效应）3 交联葡聚糖凝胶：SephadexG-254 凝胶层析特点：操作简便，设备简单；分离效果好，重复性高（样品回收率高） ；分离条件缓和，对分离物的活性无不良影响；应用广泛，适用于各种生化物质；分辨率低，分离操作慢；对分子量相差不多的物质分离困难；样品粘度不宜太高；有时有非特异性吸附现象。5
11、 实验步骤：5.1 装柱：打开下端出口开关，将凝胶匀速注入（边搅边加） ，使凝胶自然沉降到层析柱 2/3 高度处，关闭下端出口（胶面不可干！） ，表面覆盖一层溶液5.2 平衡：3 倍体积 0.2M 的 NaCl 平衡凝胶柱（压实凝胶） ，关闭柱下开口5.3 加样：血红蛋白+溴酚蓝，白瓷板混匀；吸出胶柱上面溶液，留一点点（防止进入空气） ，点样，打开柱下开关，等样品大部分深入；关闭下口，柱面上加洗脱液（3-5cm）5.4 洗脱：0.2M NaCl 洗脱。样品明显分层，上篮下红，血红蛋白先流出，接样直到液体透明。等溴酚蓝洗脱完毕，在持续洗脱 30min，凝胶回收利用。6 注意：凝胶中水不可太多；保持柱面湿润；加胶要连续；平衡时流速不宜过快，避免压胶过紧；加样时勿让柱面被冲引起凹陷，也不可让样沿管壁流下。
