1、皮肤保护中的二核甘酸检测Skin-protecting dinucleotide examinedKarin Cucumel,ISP Global Skin Research Center,FranceRaid Domloge,ISP Global Skin Research Center,France 文献来源：Published January 2008 personal care翻译：吕晓滕摘要压力作为我们生活中的一大要素正在变得越来越明显，大量的数据表明压力对人类皮肤的健康和老化有着直接的影响。压力可能来自于环境污染，天气状况，吸烟，放射物，重金属和紫外线等等。在导致压力的众多因素中，
2、紫外线是导致皮肤光老化的主要诱因，这是由于紫外线能够对皮肤中的胶原，弹性蛋白，黑素细胞和皮肤的栅栏组织，并引起皮肤褶皱，松弛，不均匀的皮肤斑点，黑斑和皮肤干燥。因此，开发一种能够对抗皮肤老化和和压力的活性物质便成为化妆品行业研究中的一个热点。位于法国安蒂波利斯地区的 ISP 全球皮肤研究中心曾经开发了一种化妆品活性物质，该物质是通过生物技术的方法从一种生活在 hypermineral 湖中的卤虫体内获得的，当环境变坏时，卤虫进入休眠状态，在休眠状态下卤虫能够压缩并加速形成一种至关重要的分子，GP4G，这是一种主要用于 DNA 保护的具有很高潜在势能的物质，同时也是一种储能物质。当环境条件适合时
3、，卤虫就会从休眠中醒来并萌发，然后进行一种不同于上述途径的代谢过程。最终，GP4G 转变成为 ATP。GP4G 为卤虫的生命活动提供能量并保证卤虫的安全与进化，本研究的主要目的就是证明 GP4G 应用于皮肤后能够通过为肌肤提供能量的方式来保护 DNA，对抗中波紫外线和皮肤老化以保证大部分的皮肤细胞出于一个良好的状态。材料与方法人类成纤维细胞由细胞培养获得，皮肤外植体由整容外科获得，然后，采用了一个确定皮肤组织的培养方案，HaCaT 细胞株由美国菌种保藏中心获得，人类成纤维细胞用卤虫提取物处理 24 小时，然后暴露在中波紫外光下，24 小时后做一个 MTT 溴比色测试。培养的皮肤样品用标准的直接
4、免疫荧光反应的方法来检测，用兔子的多克隆抗体抗-Hsp-70 进行热休克蛋白的研究，老鼠的抗-CD1a 细胞进行朗格汉斯细胞染色检测。用 12%的 NuPAGE 凝胶按照前面提到的方法进行免疫印迹实验，兔子的抗胶原多克隆抗体抗体与小鼠的单克隆抗体通过 TEBU 购买。彗星实验（单细胞凝胶电泳）是一种能够检测单细胞中单链 DNA 或双链 DNA 断裂的短距敏感的微电泳技术，简单地说，经过处理以后，细胞最终进入了琼脂糖凝胶并溶解在一种高盐的去垢剂缓冲液中，在单细胞凝胶电泳之后，将 DNA 在碱性溶液中变性，然后用碘化丙啶处理。受损细胞内的 DNA 会向正极移动，移动的速度与细胞碎片的数量呈正比，这
5、样就会在凝胶上面形成一道“彗星” 。损害评估通过一个能够帮助探测 DAN 损伤百分比的软件来进行。在人类角质细胞接收 UVB100mj/cm2照射之前或之后的 24h 内加入卤虫提取物，加入卤虫提取物 24h 之后采用原位缺口末端标记技术（TUNEL 测试技术）进行检测。人类的 HaCaT 细胞通过酶联免疫反应（ELISA）技术进行检测， HaCaT 细胞在接受UVB 照射 24h 后加入 3%的卤虫提取物。并通过 IL-1，IL-8 和 TMF-的水平来评估总细胞因子。细胞因子的水平用 pg/mg 蛋白表示。结果为了证明细胞的新陈代谢被激活，预先测定了纤维母细胞中的 ATP 含量。利用安玛西
6、亚公司的 cAMP 竞争性免疫测试系统，我们测得 ATP 的含量比本底水平上升了 40%。GP4G 是 ATP 的前体物质，并且也被证明具有能够提供能量的特征。在卤虫生长的环境中，当周围的环境适合时，卤虫从休眠状态苏醒，卤虫体内的 GP4G 的含量迅速下降，而ATP 的含量却上升明显。GP4G 机制被认为是一种能够使卤虫在严酷环境中生存下来的原因。当面临严酷的环境时，卤虫体内开始加速形成一种重要的分子-GP4G，其中含有典型的高能磷酸键。有趣的是，我们发现在环境恶劣的条件下，GP4G 是由一种能够为 ATP的形成提供能量的能量供体，储存于 ATP 中的能量在环境适宜时释放出来。因此，GP4G在
7、别的生理条件或在人体细胞中，能够激活 c-AMP 依赖的代谢途径。表皮和真皮的再生免疫染色和免疫印迹试验发现，在 HaCaT 细胞中丝聚蛋白和角蛋白的含量都有明显的增加。这项研究显示卤虫提取物能够刺激丝聚蛋白的合成，并因此促进表皮的分化。同样的，我们也证明了，在一些经过纤维原处理的细胞中，真皮蛋白如纤连蛋白和胶原蛋白也有大幅的增长。GP4G 能够通过诱导丝聚蛋白和胶原蛋白的合成来提高皮肤的栅栏功能，不仅如此，GP4G 通过诱导胶原蛋白和纤维原蛋白的合成，还发挥着细胞外基质的作用。因此，GP4G 同时为表皮细胞和真皮细胞提供保护。DNA的保护为了证明 GP4G 对 DNA 的保护，在实验中我们把
8、角质细胞放在 UVB 下照射，然后应用TUNEL 技术来探测并量化细胞凋亡。利用 TUNEL 技术原位检测 DNA 碎片显示，在照射前或照射后加入卤虫提取物的细胞中，由 UVB 引发的细胞凋亡降低了 35%，另外，在紫外照射之前或之后加入卤虫提取物，可以使 DNA 的保护率上升至 45%，这个实验结果很有意思，并且我们可以拿该实验的结果与 GP4G 在卤虫体内的生物学作用相比较，事实上，卤虫加速体内 GP4G 的合成，主要是因为 GP4G 能够抵御各种严酷的环境，并保护其DNA 和蛋白质结构的完整性。抵御 UVB的伤害前面的实验显示，卤虫提取物能够保护 DNA 免受 UVB 的伤害，基于这样一
9、个结果，我们研究了 GP4G 对暴露在 UVB 照射之下的细胞的作用。实验的研究对象是人类皮肤中的纤维母细胞。首先，细胞经过卤虫提取物的预处理，并证明其生命力提高了 20%，在实验的第二个阶段，对培养的纤维母细胞进行彗星试验检测，并且证明无论是用低剂量的UVB（30mJ）处理，还是高剂量的 UVB（60mJ 和 100mJ）处理，经过卤虫提取物处理的细胞中的 DNA 所受到的伤害都要比未处理的低（见图表 1） 。这个实验最终被暴露在高剂量 UVB 下体外皮肤研究证实，事实上，经过（卤虫提取物）处理的皮肤较好的保持了他们的结构，并且受到 UVB 的损伤也比较轻（如：很少出现被阳光灼伤的细胞） 。
10、另外，CD1a 免疫染色的朗格汉斯细胞显示，经过（卤虫提取物）处理的皮肤细胞并没有表现出数量的下降，也没有分布在朗格汉斯细胞中，然而，对照组的皮肤却出现朗格汉斯细胞大幅下降的现象，并且还出现了细胞往真皮迁移的现象，这是 UV 辐射引起免疫抑制的标志。以上的所有实验都证明 GP4G 具有能够帮助细胞抵御 UV 辐射的巨大作用。提高抵御压力的能力本研究的母的 GP4G 在细胞内或细胞外都具有抵御各种压力（如耐热性）的能力。将人类的纤维母细胞在添加了二核甘酸磷酸的培养基中培养。然后将培养的细胞 47培养1h。再将活细胞 MTT 染色。而在另外一个实验中，人类皮肤细胞的外植体分为用卤虫提取物处理的实验
11、组和用奶油处理的对照组，然后将实验组和对照组都转移到 37这样一个应力温度下复苏 24h。研究表明，经过（卤虫提取物）处理的细胞热休克的回复率比未经处理的要高。在苏木精-伊红染色中，经过（卤虫提取物）处理的细胞跟对照组的细胞相比对酷热的环境具有更强的抵抗力。与对照组的皮肤细胞相比，在酷热的环境中，经过处理的皮肤细胞表现出更强的维持细胞结构稳定的能力，并且受到的热伤害更轻。其他研究如果说 GP4G 对卤虫本身的细胞有作用还是可以解释的话，那 GP4G 对人类皮肤细胞有益，这又该怎么解释呢？现在已经证明 GP4G 能够刺激角质蛋白和丝蛋白的产生，那这又有一个问题，在 GP4G 发挥保护作用的时候，
12、他还能刺激其他蛋白的产生吗？我们将关注的焦点放在热激蛋白上面，这是一种能够保护细胞免受各种严酷环境伤害的分子伴侣。简单地说，热激蛋白（HSPs）与压力和非压力条件下的多种生理功能有关，能够增强在这种机制中起重要作用的各种蛋白的作用。HSPs 包括了 HSP70 的两种类型。在生理条件下，HSP70 对蛋白的折叠与组装，以及细胞的发育和分化起着重要作用，而在压力条件下，HSP70 结合在作为“分子伴侣”结合在未折叠和去折叠的蛋白分子上。本研究的主要目的是通过免疫染色的方法评估在人类的皮肤样本和皮肤细胞中 HSP70的表达情况。并且还检测了人类皮肤细胞中 HSP70 的信使 RNA 含量。 （结果
13、证明）无论是在角质细胞还是在纤维母细胞中，GP4G 都能够显著地诱导 HSP70 的合成。在人类皮肤中进行的相似研究证明，与对照组相比，在培养基配方中加入卤虫提取物可以显著诱导并增加 HSP70 蛋白的表达。在另外的相关试验中，我们发现 HSP70 的 mRNA 含量出现了迅速的增加。事实上，HSP70 的含量在用二核苷酸磷酸处理后 3h 即上升 70%，达到最大值。另外，不同的研究都显示卤虫提取物在没有外界压力的作用时可以诱导 HSP70 的产生。此类研究包括用 MTT 比色法测定细胞活性，也没有发现细胞活力的损失。同样的，关于IL-1 和 IL-8 的研究也没有发现这两种细胞因子的诱导合成
14、，这预示着不存在外部压力。因此，我们注意到有趣的一点是，卤虫提取物通过一种非凡的机制来起到一种主要的保护作用：它在没有压力的时候诱导人类皮肤和人类细胞中的 HSP70 的表达。细胞因子的调节作用为了进一步观察卤虫提取物（在没有外界压力的条件下）诱导 HSP70 产生的方式，我们通过研究 IL-8，IL-1 以及 TNF 等细胞因子的诱导合成来研究卤虫提取物的抗炎作用。另外一些研究表明，HSP70 能够在高温，化学物质，放射性物质等抑制细胞因子产生的条件下合成。为了了解卤虫提取物在该途径中的作用，我们将人类 HaCaT 角质细胞先用GP4G 处理 24h，然后用 UVB 照射，再进行 ELISA
15、（酶联免疫反应） 。有趣的是，在卤虫提取物诱导的细胞中，不同时间点的 IL-1 水平都出现了明显的下降，而 IL-8 的情形也与此类似。同样的，在用卤虫提取物处理过的细胞中，TNF 的含量也出现了明显的下降。所有这些的明显下降都是由学生 T 测试得到的。这些研究表明卤虫提取物，或者更精确的说，卤虫提取物在没有外界压力的条件下诱导人体细胞产生的 HSP70，通过一种新的，降低细胞因子反应的方式来治疗人类皮肤一些炎症。卤虫提取物对类维生素 A治疗皮肤的影响根据前面对卤虫提取物在各种压力条件下降低人体细胞和皮肤中的细胞因子含量过程中的作用，我们的兴趣转向了 GP4G 在用全反式维甲酸（ATRA）处理
16、的皮肤细胞中的作用。我们知道，维甲酸在各种皮肤病中都有着广泛的应用，本研究发现细胞中的维甲酸能够降低 HSP70 的含量。这种现象是在应用的第一周发现的，并且随着时间的推移越来越明显。卤虫提取物能够显著增加经过 ATRA 处理过的细胞或皮肤样品中 HSP70 的含量。另外，前面的数个研究成果都显示 ATRA 的局部应用可以增加细胞中的炎症因子。并研究了卤虫提取物对 ATRA 和 GP4G 处理过的细胞中 IL-1 的含量的影响。结果证明 ATRA 对人类细胞和皮肤都具有促炎症作用，而卤虫提取物则可以降低这两者中的炎症因子。这个研究证明了 GP4G 在提高皮肤舒适度上与维甲酸是相互关联的。结论人
17、们越来越认识到皮肤时间在太阳光下曝晒会带来风险，随着这种认识的普及与增长，人们重新对保护皮肤免受 UV 的伤害变的重视起来。如今，人们已经知道 UV 可以损伤细胞中的 DNA，可引起光老化并具有致癌作用。在阳光下暴晒和其他因素和其他因素可加速皮肤的老化进程-这些因素包括吸烟，空气污染，恶劣的气候环境以及现代生活中的各种压力。卤虫提取物通过其所含有的 GP4G 和 HSP，能够在很大程度上保护皮肤。事实上，卤虫提取物具有多种保护功能，其中的一些是由 HSP70 诱导介导的，能够缓解细胞的压力。除了 HSP 的细胞保护功能之外，卤虫提取物中的 GP4G 还具有“细胞营养激活者”的作用。GP4G ，
18、能够通过 GTP，绑定在 G 蛋白上，并激活细胞的新陈代谢。 GP4G 还富含磷，鸟嘌呤等组成一些重要分子（如，DNA,RNA,磷脂质）的重要元素，磷还是很多细胞结构的微量元素，比如说磷脂膜。鸟嘌呤是皮肤细胞再生过程中合成 RNA 和 DNA 的一种重要的核苷酸。GP4G 作为皮肤细胞中名副其实的生物助推器，它能够提升皮肤的栅栏作用并促进真皮的再生。另外，研究数据表明卤虫提取物能够保护 DNA 并降低 DNA 的损伤。因此 GP4G可以用来增强防晒霜保护皮肤的作用。此外，GP4G 能够降低细胞中炎症因子的数量，从而起到抗炎的作用。因此，卤虫提取物在医疗以及化妆品等方面具有极大的应用。GP4G 具有广泛的途径来帮助细胞抵御压力，因此在抗老化产品以及防晒品，以及敏感皮肤和炎症皮肤护理中都具有广泛的应用。
