1、有机质谱原理,浙江大学理学院 无机与材料化学研究所 刘子阳 教授，博士生导师电话：0571-87951158（办公室）13516726973（手机）,第二章：有机质谱仪器,Components of any Mass Spectrometer,第二章：有机质谱仪器,Sample Inlet,Gas e.g. from a gas chromatograph (GC/MS) Liquid e.g. from a liquid chromatograph (LC/MS) Solid solid probes (DIP, DCI),2.1 进样系统,一、储罐进样包括：储气室加热器真空连接系统分子漏孔
2、用途：特殊样品的引入，校正仪器的样品，特殊的气体样品，用于研究的样品(如气相离子化学、反应质谱等)。,二、探头进样用途：固体样品或高沸点液体。,三个条件： 样品在离子源中电离前必须气化在气化过程中样品不发生或少发生热分解样品能在离子源中维持一定的蒸气压,热分解： 带有离子型官能团，如季铵盐有易形成氢键尤其是与探头表面形成氢键并引发分解的非离子型官能团。大分子量分子。解决办法：快速升温 三种方式 束内技术(in beam) 探头内装加长毛细管，其前端伸至电子束位置，对不稳定样品获得更强的分子离子信号。 解吸电子轰击电离(Desorption Electron Impact, DEI) 解吸化学电
3、离(Desorption Chemical Ionization, DEI),三、气相色谱进样1、填充色谱进样系统色谱柱较粗，直径46mm载气流速大，几十ml/min单极喷射式玻璃分子分离器原理：扩散能力不同载气一般为氦气，分子小，扩散系数大。样品分子较大，扩散系数较小。喷射过程中，样品分子得到富集。,2、毛细管气相色谱柱进样系统载气流速小、柱子细，直接插入电离盒中。,四、液体泵或液相色谱进样目前主要与电喷雾和大气压化学电离质谱联用。1、液体泵进样注射器毛细管输送样品到电喷雾尖端流速可控制在0.5500l/min适用于纯样品的分析或进行质谱研究等。,2、液相色谱仪进样系统将液相色谱流出物直接通
4、过进样毛细管送到电喷雾电离源内，与液体束相似。液相色谱流速问题。洗脱剂中的缓冲盐等问题。,2.2 电离方式和离子源种类繁多，介绍主要的几种。,Ionisation,Hard,Soft,No Fragments,Fragments,API,EI,CI,Soft ionisation gives low fragmentation Molecular weight determination Produces “theoretical” spectra High sensitivity (low pg levels),一、电子轰击电离 (Electron Impact, EI),1、组成部分灯丝：
5、钨、铼或铼钨丝，发射电子，电离样品收集极：接收灯丝发射的电子推斥极：推出产生的样品离子永久磁铁：使电子做螺旋运动，增加电离几率,2、电离效率曲线灯丝产生的电子被加速到70eV,保证电离的重现性。为什么？ 电离效率随电子能量的升高而升高，当达50eV时，基本达到最大值，实验上设定电子能量为70eV。 此时，产生的谱图有稳定的指纹特征。,电离效率曲线,电子能量对质谱图的影响,不同能量下获得的苯甲酸的质谱图,二、化学电离 (Chemical Ionization, CI),利用反应气体的离子与样品分子相互反应，而使样品分子离子化，本质是化学过程，故称化学电离。离子出品的缝隙减小，使高子室内的压力保持
6、在0.5-1.0Torr。电子轰击化学电离气体，不直接作用于样品分子。推斥电极电压：0V，增加源内停留时间，有利于离子-分子反应。化学电离试剂：甲烷、异丁烷、氨气，氢气，水、甲醇、胺等。,以甲烷为例，化学电离源内的有关离子-分子反应，CH4 + e CH4+ + CH3+ + CH2+ + CH+ + C+ + H2+ + H+CH4+ + CH4 CH5+ + CH3CH3+ + CH4 C2H5+ + H2CH5+ + XH XH2+ + CH4C2H5+ + XH XH2+ + C2H4C2H5+ + XH X+ + C2H6,化学电离离子-分子反应常见类型 质子转移反应 BH+ + M
7、 MH+ + B 氢负离子转移反应 BH+ + M M-H+ + BH2 电荷交换反应 B+ + M B + M+ 加成反应 BH+ + M BHM+ 或 BMH+,三、二次离子质谱(Second Ion Mass Spectrometry,SIMS)快原子轰击(Fast Atom Bombardment, FAB), Ar原子快离子轰击(Fast Ion Bombardment, FIB) Cs离子,FAB： Ar 与被加速到20kV的Ar+进行弹性碰撞，使Ar获得相应的动能，射向样品靶，产生轰击作用。 FIB： Cs+由CsI加热后放出来，然后通过电场加速到20kV，射向样品靶，产生轰击作
8、用。 适用于极性分子的分析，生物分子，质量在2000以内。,基质的作用：一般为强极性分子，对快原子或快离子有较强的吸收能力，可使进样品溶液溶解，溶剂挥发后，基质结晶，样品均匀分布于该结晶体中，轰击时一起蒸发。,FAB/FIB常用基质,四、等离子体解析质谱(Plama Desorption, PDMS)放射性同位素(252Cf)的核裂变碎片作为被级粒子轰击样品使其电离。样品涂布于0.51m厚的铝或镍箔上，252Cf的裂变碎片从背面穿过金属箔，把能量传递给样品分子。,252Cf的主裂变产物是 Ba18+和Tc22+，动能分别为79MeV和104MeV，高于FAB和FIB的能量。在10-12秒内产生
9、碰撞，使样品不发生分解。基质：基本同FAB和FIB，还有硝化纤维素。 适用于极性分子的分析，生物分子，多肽或蛋白质所测定的质量高达14000Da。,五、基质辅助激光解吸电离(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization, MALDI),试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。 基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。 基质吸收大部分激光能量，减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。 激光：固体氮激光，紫外光波长： 337nm 功率：106108W/cm2脉冲时间：10-610-9秒,关于基质： 极性化合物 溶解
10、样品 芳环 吸收激光 易结晶 均匀分散样品分子MALDI常用基质, 蛋白质组分析。,MALDI的特点：优 点 ：质量范围可达50万Da。高灵敏度，可测至10-1210-15摩尔。软电离，没有或很少有碎片离子，可用于分析混合物。可容纳毫摩尔级的盐。 缺 点 ：基质背景易干扰质量数1000Da以内的物质分析。激光解析电离可能导致被分析物分解。,六、电喷雾电离(Electro-Spray Ionization, ESI),毛细管 直径0.10.2mm。喷雾电压：毛细管尖端与离子引入口之间，38kV。壳气(Sheath gas), 从毛细管端与喷雾反向加热后流出。离子通过取样锥(Skimmer)和毛细
11、管(Capillary)传送至光学聚焦系统。,电喷雾电离的基本过程电场下的喷雾 带电雾滴壳气的作用下 溶剂的蒸发 电荷的库仑作用 带电雾滴的解体Rayleigh 极限 表面张力和库仑斥力的平衡点,Reproduced from Kebarle, P. J. Mass Spectrom. 2000, 35, 804-817.,电喷雾电离产生多电荷离子：,可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子， 相当于将质谱仪的质量范围放大的n倍。,多电荷离子的有关计算,对于蛋白质，产生的多电荷离子为：M+nHn+，系列离子假设某一质谱峰(m/z)1对应的离子为M+nHn+, 另一相邻质谱峰(m/z)2对应的
12、离子为M+(n+1)H(n+1)+, 且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值:,解方程组得到M和n。可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。,例 肌红蛋白电喷雾质谱图带1030个电荷的系列分子离子,七、大气压化学电离(Atmosphere Pressure Chemical Ionization, APCI),毛细管样品送入加热管中，该管可以达到300C以上。在加热管中溶剂挥发。加热管出口处放置电晕(Corona )放电装置, 使挥发出来的溶剂分子电离，形成等离子体。等离子体与
13、样品分子反应，生成MH+或MH准分子离子。,APCI特点软的电离方式，样品直接从液从中拉出来的，不是蒸发，基本不产生分解，电离过程属于离子-分子反应，与CI原理相似。快速地适合高低含量水溶液的流动相，可作梯度分析。 单电荷峰，实现源内CID。,Which Ionisation Mode?,仪器的加速电压V：使离子具有高的动能，快速通过磁场、电场和无场区。 某一离子：质量为m，电荷价态为z，从加速电场获取的电能为zeV。该离子的动能为1/2mv2 v为离子的运动速度，两个能量是相等的。即：,2.3 质量分析器种类繁多，磁场、电场、射频场对电荷离子的控制作用。,一、扇形磁场和静电场 (Sector
14、 Analyzer),离子在扇形磁场中的运动,1、离子在扇形磁场中的运动,进入磁场后，离子在磁场的作用下作圆周运动，则：,B为磁场强度，r为离子的运动半径，即磁场的半径。 合并以上两式得：,具有不同质量的离子具有不同的轨道半径，质量越大，半径越大， 表明磁场具有质量色散能力，可单独作质量分析器。 若 r 固定(当仪器的磁场确定后，r实际上就固定下来)，上式改写为：,k为常数,离子的质荷比与磁场强度的平方成正比，与加速电压反比。固定加速电压，扫描磁场可使离子依次通过磁场，从而达到离子按质量分析。磁场为质量分析器。,将离子动能 mv2/2=zeV 代入上式，则得：,半径为re圆弧上，电场强度为：
15、其中E为静电场的电压。,若Er固定，则离子运动半径随加速电压的改变而改变，因此静电场是能量分析器。,离子在扇形电场中的运动,2、离子在扇形电场中的运动,Er 为离子运动轨道上的电场强度 re 为离子在电场中作圆周运动的半径，即电场的半径。,代入 re = 2V/Er中得：E = V lnr1/r2, r1和r2是固定的。 所以，在双聚焦质谱仪中，静电场电压与加速电压维持着一定的比例关系。,反置式双聚焦高分辨质谱仪离子光学,2、双聚焦质谱仪基本原理,扇形磁场质量色散，分析离子原因，实际上是动量分析器。方向聚焦，相同质量和相同速度的离子，从同一点以不同角度入射到磁场中，在磁场中所走轨迹不同，但在磁
16、场后可集中于某一点，与方向无关。 静电分析器能量分析器 方向聚集，同磁场。,离子源中引出的离子：运动方向不平行。存在能量色散，初始的温度分布和电子轰击时所产生的附加动能。,双聚集方向聚焦：磁场和电场，大小相同，方向相反，互补作用，使不同方向的离子聚焦于检测狭缝处，能量(速度)聚焦：磁场和电场，大小相同，方向相反，使不同能量的离子聚焦于狭缝处。狭缝：能量不同的离子聚焦于狭缝处，调节该缝的宽度可以使通过的离子的能量范围不同。实现高分辨。,两组四极杆分别加上 +(u+Vcont) 和 (u+Vcont)， 其中u直流电压部分，Vcont为射频电压部分 = 2f, f为频率。 理想的四极场为双曲线型，
17、但加工的困难，用四根杆代替。 在四极场中任一点的电场为：,二、四极杆质量分析器(Quadrupole Mass Analyser),在场的中心和两条对角线上的任何一点电位为零。,离子在射入四极场后，其运动方程ma = eE a为离子加速度，E电场强度 电场强度为电位的导数。则上式在直角坐标系展开为：在四极场中任一点的电场为：,代入上式得：,令：,合并上 几式得：,Mathieu 方程,Mathieu方程解，复杂，与边界条件密切相关。 以a, q为坐标，方程的解作图，三个区：稳定区，x不稳定区，y不稳定区。 a, q都是交直流电压幅值、频率和时间的函数，可由仪器设定和调节，r0 是仪器中心到四极
18、杆的径向距离，其值是确定的。,扫描线：与稳定区相截并且 通过原点的直线。在这条直线上，各处的a/q比值都为常数，即 u/V = a/q 亦为常数。同质荷比的离子对应有不同的a, q值，对于具有使 u/V = a/q为常数的离子来说，其a和q值均在扫描线上。如果其值恰好处于扫描线和稳定区的两个边界交点(A，A)之间，则该离子落在稳定区之内。改变u/V 的比值，扫描线斜率变化，增加，AA长度减小，即能够稳定的离子减小，分辨率增加。AA长度仅与u/V比值有关。固定u/V比值(即保持AA长度不变，也就是分辨率不变)，改变V的幅值，可使不同质荷比的离子先后进入稳定区，顺序通过四极杆之后被接收，得到一组不
19、同质荷比的质谱。,稳定区: 离子产生稳定的振荡，沿z方向通过四极杆。 不稳定区: 离子振幅不断增大，最后飞出四极场或与z和y电极碰撞中和。,离子阱质谱由四极杆质谱仪发展而来。 四极杆变为环极，四极杆两端加端帽。 端帽和环极上均加有直流电压U，射频电压 (振幅为V，角频率) 。 离子的运动仍由Mathieu方程描述。 较理想的离子阱质量分析器：r02 = 2z02,三、离子阱质量分析器(Ion Trap Mass Analyser, IT),Mathieu方程的解：蓝色区为稳定区，其它为不稳定区，空间分布，这里仅是一个截面。 捕集时(Trapping)，设定U, V 和 ，使各种离子在蓝色区域的
20、最式边。 扫描时(Scanning)，给定U, V 和 ，使扫描线按 qz=0 的由左到右进行，离子从小质荷比到大的质荷比依次排出到检测器。,离子阱中引入10-3 Torr 氦气，使离子运动受到阻尼，提高离子轨迹的稳定性，进而提高仪器的分辨率和灵敏度。,二级质谱：捕集(Trapping)， 排除(Elimination)捕获(Capture)， 碰撞(Collision)扫描(Scanning) 检测(Detection) 多级质谱：上述步骤的重复过程。,Trapping 1 Elimination 2,Capture 3 Collision 4,Scaning 5,离子阱的多级质谱分析,四、
21、飞行时间质量分析器(Time Of Flight Mass Analyser, TOF),离子源中的离子经加速电压获得的速度为： 其中 ze为电荷，V为加速电压，m为质量。,飞行管长度L，到达检测器的时间为： 质量越大，飞行时间越长，实现分离。,m1和m2两个离子：,用已知样品进行校正，得到未知离子的质量。,仪器的分辨率近似为：,提高加速电压，增长飞行管长度，都可提高分辨率。 但导致分辨率较低的主要原因是离子源得到离子的能量色散作用，即分子的热运动的影响，使得离子的被始速度不一致。 解决离子热运动，提高分辨率的方法： 两级加速法：先用一级加速，离栅极较远的离子获得更多的动能，提高速度，追赶上离
22、栅极近者，然后再经栅极加速后，一起进入飞行管。 Delay Extract技术：在激光脉冲开启的瞬间，没有加速电压存在，离子处于一种无场运动，不同速度的离子向栅极运动的距离不同，一定时间过后(很短的时间)，加上加速度电压把离子引向栅极，此时，前面具有不同速度的离子处在不同的位置，速度快者，离栅极近，速度慢者，离栅极远。加上电压后，处于不同位置的离子获得电场能，离栅极近者，获得的电场能小，离栅极远者获得电场能大，前者本身速度快，被始动能大，后者速度慢，初始动能小。动能小者从栅极电压获得相对多的电场能，动能大者从栅极电压获得相对少的动能，从而使两者加速后，动能的差异减小，即减小能量色散。从而提高分
23、辨率。,飞行时间质谱仪,反射式或折射式：靠电场将飞行的离子反射回来，在反射端接有检测器。好处： 提高分辨力和灵敏度。对灵敏度的提高：中性分子也会在电离过程中产生，并飞向检测器，但中性分子不能被反射，不能到达反射检测器所在位置，减小本底噪音，提高灵敏度。对分辨率的提高：速度快的离子动能相对较大，克服电场阻力的能力大，打入到反射电场的深度大，反之，速度慢的离子打入反射电场的深度小，前者因打入电场深度大，多运动一段距离，后者因小运动的了段距离。快者多走路程，慢者少走路程，最终两者几乎同时到达检测器，提高了分辨力。 折射式原理同反射式，只是多反射了几次，提高分辨力，但可能减小灵敏度。,五、傅立叶变换离
24、子回旋共振质量分析器(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance，FT-ICR),离子沿平行于磁场方向进入ICR-Cell，加在垂直于磁场的捕集电极上的低直流电压形成一个静电场将离子拘禁于室中。在磁场作用下，离子在垂直于磁场的圆形轨道上作回旋运动，其回旋频率 仅于磁场强度 B 和离子的质荷比m/z有关：,式中 为赫兹(Hz), B为特斯拉(T), m为原子质量单位(u)一组不同空间位置上m/z值相同而速度不同的离子将以同一频率运动，离子的速度只影响其轨道半径。,式中 为赫兹(Hz), B为特斯拉(T), m为原子质量单位(u)一组不同空间位置上m/z值相
25、同而速度不同的离子将以同一频率运动，离子的速度只影响其轨道半径。,通过发射电极向离子加一个射频电场；若射频电压的频率正好与离子回旋的频率相同，离子将共振吸收能量，使其运动轨道半径和运动速度逐渐稳步增大，但频率仍然不变。当一组离子达到同步回旋之后，在接收电极上产生镜像电流。根据镜像电流的频率可以计算出离子的质量。,在实际测量中，多种离子同时产生，在回旋池中加一个频率范围覆盖了所有感兴趣离子的脉冲射频。脉冲结束后，所有受激离子诱导的镜像电流在接收电路上形成各自的阈衰减信号；这个复合的时阈误减信号经傅里叶变换为与质量相关的频阈谱图。对镜像电流取样的时间越长，质量分辨率越高。但碰撞阻尼破坏离子的同步回
26、刻运动，从而使镜像电流衰减加快。高真空有利于提高分辨率，同时还可改善信噪比。,2.4 几种常见商用质谱仪,一、磁质谱仪Finnigan MAT-900XP,High resolution, double focusing mass spectrometer.Acceleration voltage Full acceleration voltage for all ionization modes Mass range 5,000 Da at full acceleration potential Resolution better than 60,000 Mass accuracy bett
27、er than 2 ppm,二、四极杆质谱仪Finnigan TSQ Quantum,Mass Range: 3000 Daltons.,三、离子阱质谱仪Finnigan LCQ Advantage,四、飞行时间质谱仪Applied Biosystems Super Voyger,Super Voyager- DE -STR展现了MALDITOF强劲的应用前景。长距离的飞行路径（3米）使分辩率达到了最好的程度，高性能探测器配合信号的快速转化和传送可获得非常高的灵敏度。可分析较为复杂的混合物，在样品含量低于10-12摩尔时，分子量的测定仍有相当高的灵敏度和分辩率。 VOYAGERDE STR可进
28、行PSD和CID MS/MS实验。可通过测量准确的分子量来进行数据库查寻。,五、FT-ICR-MS Bruker Daltonics APEX IV,Routine mass accuracy 1-2 ppm, mass resolution up to several 100.000. Fast MS/MS fragmentation using IRMPD (Infrared Multiphoton Dissociation). Low-noise pre-amplifier and new flexible Infinity Cell Controller for higher sensitivity,Various, easily exchangeable sources: Improved APOLLO ESI/APCI source, SCOUT-100 MALDI source with patented AnchorChip technology, High Throughput MALDI/ESI CombiSource, NanoElectrospray, FAB, SIMS, EI/CI,
