1、稳定同位素标记,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,稳定同位素标记,代谢标记法：在培养基中添加15N或其他同位 素氨基酸（15C或2H)的氨基酸，细胞 经过若干代培养后，蛋白质将完全被 同位素标记，等量混合标记与没有标 记同位素的样本、液相色谱和SDS-PA GE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。,化学标记法：在收集蛋白质样品后，利用化学 反应在蛋白质或肽段的特殊位点引入 同位素标签，等量混合标记与没有标 记同位素的样本、液相色谱和SDS-PA GE的分离，然后进行质谱鉴定和定量。,常见的同位素标记技术,代谢标记法：（1）15N标记法（2）细胞培养中含有稳定同位素的氨
2、基酸标记法（SILAC)化学标记法：（1）ICAT法（2）iTRAQ法,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,代谢标记法15N标记法,简介：在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。优点：高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%；重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；灵活性：在培养基中添加同位素标记15N ，操作方便。
3、缺点：（1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。（2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,代谢标记法SILAC,简介：SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术，在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，细胞经传代培养若干代后，蛋白质将被同位素稳定标记，等量混合标记的蛋白质后分离和质谱鉴定，根据一级质谱图中三个同位素型肽段的面积比较进行相对定量和二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴
4、定蛋白质。,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,代谢标记法SILAC,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,代谢标记法SILAC Labelin corporation,随着细胞培养的传代，细胞种原有的”轻“型蛋白质逐渐被”重“型蛋白质蛋白质代替,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,代谢标记法SILAC,技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法（1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%；（2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；（3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百
5、至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平；（4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记；（5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,化学标记法ICAT,A: ICAT试剂结构，包括3个部分， SH反应集团， biotin标签，同位素臂， 试剂具有两种形式：重型（含8个氘） 和轻型（不含氘）B: ICAT标记定量技术流程，来源不同 处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和 轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合， 胰蛋白酶酶切，亲和纯
6、化得到ICAT标 记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰 图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。,化学标记法ICAT,ICAT法的缺点：（1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。（2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻（3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化，（4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰物，会增加数据库搜索的复杂性（5）标记时通常需要延长
7、时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。（6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生-消除反应使部分标签断裂。,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,化学标记法iTRAQ,简介：iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。iTRAQ 结构,iTR
8、AQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8组样品。2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同。,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,化学标记法iTRAQ,iTRAQ技术服务流程：,iTRAQ法。 1：样本经过不同处理后，提取蛋白质; 2：蛋白质经过还原，封闭后胰蛋白酶酶切; 3：肽段混合物分别用不同的iTRAQ标记; 4：等量混合各种不同iTRAQ标记好的肽段; 5：MS/MS质谱检测及分析。,辉骏生物：http:
9、/ 免费服务热线：400-699-1663,与传统双向凝胶电泳技术相比较，iTRAQ技术主要特点：（1）灵敏度高：检测限低，可检测出低丰度蛋白，（2）分离能力强、分析范围广、高通量：可同时对8个样本进行分析，对膜蛋白、疏水蛋白等DIGE技术不能检测的蛋白进行标记，同时可以标记修饰后的氨基酸。（3）结果可靠：由于报告离子是小分子物质，因此在质谱中很容易与其他肽段片段离子区别，保证了定量的准确性。；（4）自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。（5）可绝对定量：在样本中加入iTRAQ试剂标记的已知量的标准蛋白，可以对样本中的蛋白质进行绝对定量研究缺点：（1）iTRAQ几乎可以标记所有的蛋白质，因此样本的污染对结果有影响。（2）iTRAQ标记反应体系中有机体积高达60%以上，蛋白质非常容易发生沉淀而损失。,化学标记法iTRAQ,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,常见同位素标记比较,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,THANKS!,辉骏生物：http:/ 免费服务热线：400-699-1663,
