1、实验9-10 烟草悬浮细胞的培养与保持,目的要求: 了解植物细胞悬浮培养和平板培养的基本原理，掌握植物细胞悬浮培养和平板培养的方法和技术，掌握无菌操作技术。,原理： 植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。 由于培养物的密度及细胞生长速度等状态与培养基中养分的消耗有关，当培养物生长到一定时期就会进入分裂的静止期。需及时进行细胞继代培养， 悬浮培养的细胞又可进行固体培养，再次获得愈伤组织。愈伤组织的疏松程度及再分裂的能力可通过培养基中生长素和细胞分裂素的比例及浓度来调控。,1. 材料：烟草悬浮培养细胞。 2. 试剂、培养基：实
2、验8中配制好的培养基；75酒精。 3. 器具：无菌培养皿、移液器、无菌移液器嘴、酒精灯、脱脂棉球、烧杯、标签纸、记号笔、超净工作台、恒温培养箱、恒温空气摇床、光照培养箱。,实验材料、试剂及器具：,1接种前，用75酒精擦拭超净工作台，将培养基和接种用的器具放入超净工作台；打开超净工作台紫外灯，照射2030分钟后开送风开关，10分钟后可进行无菌操作。 2. 用75酒精对移液器和手进行表面消毒。 3. 在酒精灯上对装有培养基或培养物的三角瓶或培养皿进行开封，用无菌的移液器取悬浮培养的烟草细胞至不同的新鲜培养基中：10ml悬浮细胞至50ml新鲜液体培养基中；用移液器取1ml悬浮细胞至固体培养基上，倾斜
3、平板，用移液器移去多余的液体。将对三角瓶或培养皿进行封口、标记。 4. 培养：把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120rpm。培养温度为28，在黑暗中培养。把固体平板放入光照培养箱中， 28，黑暗恒温培养。 5. 一周后观察、记录并继代培养：（取悬浮细胞，用FDA染色，观察细胞的死、活），记录细胞生长、死亡情况；污染情况；愈伤组织的生长状态。并对悬浮培养细胞再进行继代培养，以用做进一步的实验材料。,无菌操作及接种方法与步骤 ：,针对观察结果，对实验操作步骤和要领进行分析，总结影响实验结果的主要原因。,作业:,结果观察：（1）细胞生长、死亡情况 （2）污染情况 （3）愈伤组织的生长状态 （4）中性红染色观察液泡或：改良苯酚品红观察细胞核完整性（凋亡情况检测）或：质壁分离情况及膜皱缩情况观察,
