1、液相色谱-质谱联用一、液质发展史1.质谱发展简史质谱作为检测器，具有灵敏度高、专属性好的特点，与其他色谱技术相连接，已广泛的应用于各个研究领域。欲学习液质，我们先了解一下质谱发展的过程19 世纪末，E.Goldstein 在低压放电实验中观察到正电荷粒子，随后 W.Wein 发现正电荷粒子束在磁场中发生偏转，这些观察结果为质谱的诞生提供了准备；1912 年，英国物理学家 Joseph John Thomson 研制出世界上第一台质谱仪（ 1906 年诺贝尔物理学奖获得者、英国剑桥大学教授）；1917 年，电喷雾物理现象被发现（并非为了质谱）；1918 年，Dempster 180磁扇面方向聚焦
2、质谱仪；1935 年，马陶赫(Marttauch)和赫佐格(R. Herzog)根据他们的双聚焦理论，研制出双聚焦质谱仪；1940 年，尼尔(Nier) 设计出单聚焦磁质谱仪，又于 1960 年设计并制成了一台小型的双聚焦质谱仪；1942 年，第一台商品质谱仪；1953 年，由鲍尔(Paul) 和斯坦威德尔(Steinwedel)提出四极滤质器；同年，由威雷(Wiley)和麦克劳伦斯(Mclarens)设计出飞行时间质谱仪原型；1954 年，英格拉姆(Inghram)和海登(Hayden) 报道的 Tandem 系统，即串联的质谱系统(MS/MS)；1955 年，Wiley 一般是溶剂加合物及
3、 NH4+ (M+18), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 *流速范围大，从 0.2 到 2.0mL/min ，而不用分流。（三）质量分析器任何质谱仪的基本功能都是分析气态离子。样品的电离过程和蒸发都在离子源中进行。质量分析器分析那些离子，当它们进入检测器时，控制它们的移动，并将它们转化为实际信号。 1、单四极杆质谱仪四极杆工作原理四极杆质量分析器由四个平行的杆组成，DC 和 RF 电压被加载在四极杆上，用于过滤除了某个特定的质荷比数值离子以外的所有离子。四根杆都施加 RF 电压，但是负“” 极杆与正“+”极杆相差了 180 度。杆根据施加的 DC 电压标记了 +和 。当施
4、加某个电压时，只有某个特定数值的质荷比的离子能通过四极杆到检测器中，就算所有的样品都在源中产生离子。当电压变化成其它数值，其他质荷比的离子也能通过。因此，一个完整的质谱扫描就是应用到四根杆上的 DC 和 RF 电压不断的变动。一个精确设定的 RF 和 DC 电压被加载到杆上，该电压允许某个质荷比通过。如果对于 DC 和 RF 电压对来说质量过大的离子将会漂到负极杆，因为 RF 力不足以克服离子动力。当正极杆有一个负电压的时候，质荷比低于所选择的质荷比的离子将会加速而漂到正极杆。这个过程将过滤超过带宽的质量。这个带宽是通过在调谐文件中设定的 DC 和 RF 的比值确定的。施加于杆的 DC 和 R
5、F 电压会改变，这样下一个质量数就可以通过进入检测器。四极杆分辨率这是马修稳定图，是 RF 和 DC 电压的结合图。这张图可以预测给定的离子在四级杆场中是否稳定。对于特定的 RF 和 DC 电压，包含这个点的在质谱区域内的离子将会通过进入四级杆进入检测器。这条扫描线由调谐文件中设置的宽度增益和宽度补偿决定。如果降低宽度补偿，扫描线将会下降，峰宽度将会加宽,分辨降低。如果扫描线被提高，峰宽度将会变窄,分辨率增加。2、多级串联质谱仪三重四极杆为了使用四极杆进行多级质量分析，需要按顺序摆放三个四极杆。每个四极杆有独立的功能：第一个四极杆 (Q1) 用于扫描目前的质荷比范围，选择需要的离子。第二个四极
6、杆 (Q2), 也被称为碰撞池，它集中和传输离子，并在所选择的离子的飞行路径引入碰撞气体（氩气或氦气）。离子进入碰撞池和碰撞气体进行碰撞，如果碰撞能量足够高的话，离子就会分解。碎裂的方式取决于能量、气体和化合物性质。小离子只需要很少的能量，更重的离子需要更多的能量来碎裂。第三个四极杆 (Q3)用于分析在碰撞池（Q2）产生的碎片离子。三重四极杆的扫描模式：1）子离子扫描：MS1 选择了某一特定质量的母离子，碰撞池产生碎片离子，然后在 MS2中分析。即第一个四极杆在选择性离子监测模式，第二个在全扫描监测模式。2）母离子扫描：MS1 进行全扫描，碰撞池产生碎片离子，MS2 进行选择特定的碎片离子扫描
7、。3）中性丢失扫描：MS1 和 MS2 同时扫描，监测母离子特定的中性丢失。4）单个反应监测：MS1 选择某一质量的母离子，碰撞池产生碎片离子，MS2 只分析一个碎片离子。此过程产生一个简单的单个离子碎片谱图。5）多重反应监测：MS1 选择某一质量的母离子，碰撞池产生碎片离子，MS2 用于搜寻多个选择反应监测。（四）真空系统 真空系统包含以下元件：前级泵（机械真空泵）、高真空泵（分子涡轮泵或扩散泵）、真空腔、真空规。1、真空腔 真空腔是由铝制成，有出口连接其它的元件或和质量分析器。真空腔由密封圈分成四个阶段，每个阶段的压力逐渐降低。第一阶段压力是 1torr（初级压力大约是 2torr)，第四
8、阶段压力是 10-5torr（高真空）。 真空腔表面是一个平的铝板，覆盖了真空腔顶部大的出口。真空腔的 O 形环可提供必要的密封。表面有螺母将其上紧。2、前级泵 前级泵降低真空腔的压力，以便高真空泵可以运作。它也泵走从高真空泵来的气体。前级泵与真空腔和大涡轮泵的出口连接。前级泵有一个内在的反倒吸阀，帮助防止在断电时倒流。 前级泵装有一个油肼和一个油返流管，这个返流管可以将捕集的油排回泵。一个软管将前级泵的废气放空到外面或者烟囱。机械泵在系统中降低真空至 10-1 到 10-2 torr。它也作为高真空的”后备泵” 。 前级泵通常是灌满油的机械泵。这个泵一段时间就需要维护，需要更换泵油、过滤器。
9、在维护时，总是确保出口正确放空。3、真空泵高真空泵制造低压（高真空），要求正确的分析器操作。他们通常被称为“涡轮” 泵。一个控制器调整供应到泵中的电流，监测泵马达的速度。 高真空泵将系统真空降至 10-5torr。分子涡轮泵可以提供高真空（“ 涡轮”泵） 分子涡轮泵在进口安装了马达，可以以 60,000 转速/分钟旋转。这种旋转可使在泵中的气体向下压缩偏转到另一个扇叶最终排到泵的出口，被机械泵带走。4、真空规 真空规被用于测量压力。不同的真空规测量不同范围的压力。（五）检测系统电子倍增器 在 LC-MS/MS 中的检测器是一个高能打拿极（HED)电子倍增器。检测器接受在四级杆质量过滤器中的离子
10、。产生与它接收到的离子的数量成正比的电流信号。信号被传递到电极进行放大和处理。在调谐过程中，为透镜优化电压时（这是电子倍增器的一个要素），持续变化电压。透镜的功能是直接将离子引导入高能量打拿极。被释放的电子将被引导入 CDEM 喇叭口。在调谐的过程中，产生的信号数量与其它的功能有关。 增益根据需要得到的一个离子的目标丰度所需的电压设置。三、液质联用技术的应用 液相色谱与串联质谱联用的质量分析器中最常用的是四极杆分析器，其次是离子阱分析器和飞行时间分析器。近年来，随着各种离子化技术的不断出现，液质联用技术已广泛应用于医药领域，研究较多的有天然产物化学成分分析，药物及其代谢产物研究，残留物分析，生
11、物大分子分析和临床诊断等。药学领域将液质联用技术应用于药物及其代谢产物研究是该技术在医药领域中应用最广泛、研究论文报道最多的领域。液相质谱与串联质谱联用显示了独特的优势，代表了药物代谢研究的发展趋势。在医药研究领域中，由于大量药物是极性较大的化合物，仅有约 20%的药物可用 GC 分析，其中多数还必须经过衍生化步骤，因此局限性很大。LC 可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等) ，分析范围广，而且不需衍生化步骤。MS 是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，作为理想的色谱检测器，不仅特异性强，而且具有极高的检测灵敏度。自
12、 1983 年开发串联质谱技术(MS/MS)以来，经过短短十几年的发展，串联质谱已成为一种成熟的技术，在许多领域特别是在药学领域发挥了巨大作用。1 中药及植物药化学成分的快速筛选 采用现有的常规方法阐明中药的活性成分，需对其进行大量的提取分离，得到一定量的纯化合物（一般需 5mg 以上），再进行 NMR 等光谱测定，最终确定其化学结构。整个过程需耗时数月乃至更长，不仅繁琐，而且目的性差，在确定其结构之前对目标化合物的性质了解甚少，往往分离出来的成分并不是感兴趣的化合物。LC/MS 分析则是将中药提取物先经过 HPLC 分离， 流份直接导入质谱仪进行分析， 根据采集的质谱图（一级乃至多级）， 可
13、解析流份的部分结构（如化合物类型、特征取代基等）。这样，仅需几十分钟的时间即可获得待测样品的大量化学信息， 包括化合物的可能结构（对于有些裂解规律明确的化合物， 甚至可以确定其确切结构）以及相对含量。有些微量或痕量成分在传统的分离过程中很可能被忽略，而 MS 具有高度的灵敏性，可检测到 pg 级物质，因此很容易发现新化合物的存在。显然，这些优越性是传统的植化分离方法所不具备的。2 中药品种、道地药材的鉴别很多中药材历来存在多品种、多来源的问题，尤其是同属不同种植物均作同一药材使用，或相近亲缘关系的植物以次充优，如柴胡、威灵仙、牛膝、甘草、姜黄、木通等均存在此类问题。这些植物的化学成分往往比较接
14、近，采用传统的 TLC 或 HPLC 方法有时难以找到明显的鉴别特征。而 LC/MS 因能提供大量特征性强的结构信息，可用于不同品种的鉴别。例如，中药菟丝子在药典中规定的来源为菟丝子的种子，而实际流通的药材大多来源于其相近植物南方菟丝子。以前的研究认为二者的主要化学成分均为黄酮醇，即槲皮素、山柰酚及其苷，成分基本相似，因此可以混同使用。但是对两种不同植物来源的菟丝子进行分析研究发现，菟丝子的酚性成分比目前报道的情况要复杂得多。分析人员共鉴定了 50 个成分，分别属于黄酮、木脂素及氯原酸类，其中黄酮为主要成分，且具有显著的分类学特征： 南方菟丝子的主要成分为山柰酚及紫云英苷，而菟丝子的主要成分为
15、金丝桃苷，其它酚性成分亦存在显著差异。以前的研究结果大多认为两种菟丝子的主成分均为金丝桃苷，可能是由于金丝桃苷与紫云英苷的性质十分相似，在 TLC 及 HPLC 分析中发生混淆所致。而在 LC/MS 分析中，虽然二者的保留时间比较接近，但提供的 MS 信息明显不同。3 中药质量标准研究目前中药质量控制主要是对一些主要成分或特征性成分进行定性鉴别及含量测定。但大量研究表明，中药的药效并非是某几个“指标成分” 或“主要成分”在起作用，而是多成分共同作用的结果。因此，对中药进行更为“全面” 的成分分析是中药质量控制研究的必然趋势，中药指纹图谱技术即是基于此观点而兴起的一种半定量分析技术。然而，目前开
16、展的指纹图谱研究大多数采用 HPLC/UV 分析方法，很难对其中的大多数指纹峰进行指认，导致指纹图谱难以与药物的活性直接联系起来，亦难以用于指导制剂工艺的优化。在应用 LC/MS技术之前，色谱峰的指认必须有对照品，而大多数中药化学成分的对照品是很难获得的。LC/MS 技术则可以提供未知色谱峰丰富的结构信息，据此推导其可能的化学结构，从而很好地解决这一问题。研究人员利用 LC/MS 联用技术对桂枝汤 A 部分及组成桂枝汤的五味单味药的 A 部分进行了多维全息化学特征谱的指认，对桂枝汤 A 部分产生双向调节作用的物质基础进行了初步讨论，结果发现双向调节与单向样品差别来源主要是在煎煮、提取过程中不同
17、物质溶解率、萃取率的不同，使得各个物质在最终样品中含量的不同，导致了药效的不同。这提示了桂枝汤 A 部分的提取工艺的研究应作进一步的考察，建立切实有效的质量控制方法，以保证最终质量的稳定。4 在药代动力学和药物代谢产物研究中的应用药代动力学是应用动力学原理与数学处理方法，定量描述药物在体内的动态变化规律，研究通过各种途径进入人体的药物，其吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）和排泄（excretion），即 ADME 过程，并且探讨药物在体内发生的代谢或者生物转化途径，进一步确证代谢产物的结构，研究代谢产物的药效或者毒性，使其结果为新药的定
18、向合成、结构改造和筛选服务。液质联用技术，由于其选择性强、灵敏度高（相对于传统的 HPLC 分析），目前应用于分析药物及其在各种复杂生物基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织) 中的代谢产物。不仅可以避免复杂、烦琐、耗时的样品前处理工作，而且能分离鉴定难于辨识的痕量药物代谢产物，尤其是串联质谱(QQQ)的应用，通过多反应检测(MRM)，可以提高分析的专一性，改善信噪比，提高灵敏度，从而快速方便地解决问题，带来了快速和高灵敏度的生物定量分析。由于多数药物的代谢物保留了母体药物分子的骨架结构或一些亚结构，因此，代谢物可能进行与母体药物相似的裂解，丢失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子，用串联
19、质谱分别进行中性丢失扫描、母离子扫描和子离子扫描，即可迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。 尽管 QQQ 在药物生物转化与代谢产物鉴定上取得显著的贡献，但他的局限性在于四极杆质量分析器没有足够的质量准确度，不能给出母离子和子离子的元素组成，因此，用于结构鉴定有时不够明确。与 QQQ 相比，离子阱（TRAP）在 MS 和 MS/MS 的全扫描功能上更强，而且它的多级质谱测定(MSn) 灵敏度较好，并能解释分子裂解过程。现在常常应用此功能进行代谢物鉴定。但是 TRAP 具有低质量截止点(1/3 效应) 、碰撞效率低和定量分析性能较差等缺憾，而 Q-TRAP 不但可以克服这些缺点，而且可以选择母离子
20、扫描和中性丢失扫描等。Q-TRAP 用于代谢产物是相对较新的方法，其组成相当于 QQQ 中的第 3 个 Q用线性离子阱代替，可以得到更丰富的数据。Q-TOF 可以精确测定母体药物或代谢产物分子以及由 CID 产生的碎片离子的准确质量，从而获得其元素的组成，但只有当母离子不受元素组成相同的离子的干扰时，才可能用子离子的准确质量测定去做结构解析。QQQ 以及 Q-TOF 还有一个局限性是产生的 CID 图谱不能将一级子离子与二级或三级分解子离子区分开来，使图谱解析变得困难。而 Q-TRAP 可以在质谱分析的每一阶段将母离子隔离并捕获，从而可以确定离子的亲缘关系，使代谢物的 CID 图谱的解释变得较
21、为容易。LC/MS/MS 在快速测定血浆样品中的药物浓度、研究人体药动学方面具有广泛的应用。Li X 等建立了同时测定人血浆中丹参 6 种水溶性成分的 LC/MS/MS 法，用电喷雾负离子质谱检测器，用 MRM 方式监测，结果 6 种成分能够相互分离，且在 82048ng/mL 内，线性关系良好，该法可用于丹参注射液在人体药代动力学研究。沈家骢等用 LC/MS 鉴定了新型抗镇痛剂 SPZ 247 在家兔体内羟基化及其结合型代谢物。用选择离子监测和多级全扫描质谱(MS)分析，确定了药物在体内的代谢途径和代谢物结构。杜宗敏等研究苯丙哌林在人体内的羟基化代谢过程，收集人单剂量口服 60mg 苯丙哌林
22、 024尿样，经固相萃取后用 LC/MS检测羟基化代谢产物。结果在人尿中发现苯丙哌林的 5 种羟基化代谢产物和它们与内源性葡糖醛酸和硫酸的结合物，与代谢物对照品的液相色谱和质谱信息比较，确证了其中两种代谢产物的结构分别为 4-羟基苯丙哌林和 4-羟基苯丙哌林。苯丙哌林的羟基化代谢优先发生在芳环烷氧基对位，5 种羟基化代谢产物在尿中主要以葡糖苷酸或硫酸酯结合物形式存在。5 非法掺假近年来，中成药的降糖、壮阳、镇痛疗效似乎急剧上升，在很多人以为这些中成药疗效明显，而副作用却很小的时候， 不法药品生产厂家在这些中成药中非法添加了化学物质，既迎合了国人喜欢中成药的用药习惯，又利用了西药见效快的特点，使
23、有些疗效缓慢的纯中成药，具有了暂时的速效、高效、特效。然而，在中成药中非法添加化学物质，对人的身体危害巨大，例如，在壮阳的中成药里加入枸橼酸西地那非(“伟哥” 成分)、他达那非、芬氟拉明或者甲磺酸酚妥拉明等西药，可能导致性功能减退或器官萎缩；在降压类中成药里添加氢氯噻嗪、利血平、盐酸可乐定、硝苯地平等西药，长期不合理服用会导致抑郁症或肾病甚至死亡。因此，各地药监部门已经在开展各种类型的打击“中成药非法添加化学物质” 的专项或日常工作。随着不法之徒造假手段的翻新，对打假检验手段和方法的要求越来越高，各药检部门一般采用薄层色谱、液相色谱等进行初筛，而后用液质联用、气质联用等手段进行确证，建立了一系
24、列分析方法。如药检部门的工作人员通过与对照品的色谱保留时间、紫外吸收光谱图及质谱行为进行比较，对生命糖安胶囊中非法添加的西药格列美脲进行了定量测定和定性鉴别，获得了满意的结果。食品安全食品中的化学污染物包括：农药残留、兽药残留、添加剂、加工过程中的污染物、有毒或不洁的包装材料、环境污染物、生物毒素、真菌毒素以及重金属等。对这些污染物的监测能力则是控制食品安全的关键所在。而在食品安全分析过程中的样品特点则为污染物的残留量多属于痕量或超痕量 ppb-ppg （10-910-15）分析的浓度水平；被监控的组分多，如需要检测 100 种以上的农药残留。因此，此类分析对样品的制备方法要求较高，并对分析仪
25、器的检测能力要求更为苛刻。 液质联用仪作为一种新型的现代仪器分析手段，因其高灵敏性、高准确性、高选择性、分析检测范围宽以及其定性、定量方面的强大功能等特点，在食品分析检测领域得到了广泛的应用，为确保食品质量安全起到了非常重要的作用。目前，国外 LC/MS 在农残上的应用以分析苯脲、三嗪、氨基甲酸酯、氯苯氧酸及硝基酚为主。分析仪器主要使用 QQQ 和 Q-IT。定量分析使用 SIM。不同的农药分析需要选取不同的检测模式。一般说来，中性及碱性农药，如三嗪、氨基甲酸酯、有机磷、季胺盐农药、苯脲使用正离子(PI)检测，而酸性农药，如苯氧酸、磺酰脲使用负离子(NI)检测。有时两种模式同时使用。有研究人员
26、利用 LC/MS/MS，同时测定了家禽组织中 16 种磺胺。在经过一系列前处理步骤后，用 ESI/MS/MS 进行检测，外标法定量。16 种磺胺 （磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲异唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑） 的线性范围为 0.2120ng，线性良好，方法检出限（LLOD）为 1.012.0 g/kg；方法定量限（LLOQ ）为 2.024.0g/kg。还有研究人员用 LC/MS/MS 方法建立了同时检测桔子中甲胺磷等 73 中农药的方法，分析时
27、间短（30min），且在 10-200ppb 范围内线性良好。去年的爆发了震惊中外的“三聚氰胺事件 ”后，科技部面向社会征集快速检测液态奶和奶粉中三聚氰胺的技术及产品。目前食品及饲料中三聚氰胺的检测有多种，但比较成熟的方法有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱法（LC/MS）、气相色谱- 质谱法 （GC/ MS） 3 种。LC/MS 法由于检测灵敏度高、前处理相对简单（不用衍生化）等优点，越来越多地被应用于“三聚氰胺”的检测中。代谢组学代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后) 其代谢产物的变化或其随时间的变化，研究生物体系代谢途径的一种新技术。代谢组学以生物体液为研究对象，包括尿液、胆汁、血浆、组织提取液、脑脊液、精液、唾液、膀胱液等，力求分析生物体系中的所有代谢产物，整个分析过程应能尽可能地保留和反映总体代谢产物的信息。 代谢组学要求分析生物体系中所有的代谢产物，单一的分析技术难以满足这一要求。气质联用技术(GC/MS)具有高灵敏度、高重复性、可检库鉴定已知物等特点，其局限性是样品必须气化，且不能分析大分子、难挥发性物质和热不稳定性物质；核磁共振(NMR)对样品无损伤且重复性好，广泛应用于药物工业和病人的尿、血样分析，但其灵敏度不高，不能
