AMD患者抗VEGF治疗效果的相关因素研究.doc

1、 【实验设计】AMD 患者抗 VEGF 治疗效果的相关因素研究负 责 人：尹晓光报告编号：撰 写 人：尹晓光签名 日期审核/批准：部门负责人 日期项目负责人 日期关键词： KH902 湿性 AMD 基因检测 免疫分析 预测 仅限康弘生物使用归档编号：归 档 人： 日期：康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 2 OF 16目 录1. 研究目的地 32. 缩写词 33. 背景介绍 34. 检测指标 114.1 外周血 .114.2 眼科检测 .125. 可行性分析 126. 文献 13康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 3 OF 161. 研究目的从 AMD 发生和发

2、展相关的易感基因、环境因素、炎症反应和 VEGF 信号通路等因素中筛选出一些检测指标，并研究这些指标对 KH902 治疗湿性 AMD疗效的预测潜力，为今后临床预测 KH902 的疗效提供实验依据。2. 缩写词3. 背景介绍AMD (老年性黄斑变性)是 60 岁以上老年人致盲的主要原因，临床分为干性（非渗出性，或萎缩性）和湿性（渗出性，或血管新生性）2 种类型。湿性AMD 的临床进展期特征是脉络膜血管新生（CNV ） ，结果可导致病人视力快速丧失。AMD 疾病的具体发病机制尚不清楚，大量研究结果表明 AMD 是由环境和遗传等因素干预的一种综合病症。目前提出多种 AMD 发病机制的假说，诸如氧化应

3、激假说、老年化、炎症免疫假说等。年龄是影响 AMD 主要的因素之一，其他危险因素有吸烟、肥胖、种族、家族史、性别及血压等。近年来，许多重要的 AMD 相关基因陆续被报道，包括补体因子 H(CFH)、补体因子 B(CFB) C5、C3、C2 和 VEGF 等。临床上大多干性 AMD 最终发展成湿性 AMD，导致疾病的快速进展。许多因子参与 AMD 的 CNV 的形成过程，其中 VEGF 是引起 CNV 发生和发展的主要细胞因子，抑制 VEGF 是治疗眼底 CNV 疾病的新策略。KH902 是一种抗 VEGF 药物，被用于治疗 CNV 有关疾病。目前 KH902治疗湿性 AMD 的临床试验已进入期

4、，接受药物治疗的 AMD 病人表现出不同程度的视力恢复。Silvia 在 avastin 治疗 CNV 临床试验中，发现约 45%病人出现了对药物治疗无反应，目前原因还不清楚【Silvia Bopp，2007】 。为揭示抗VEGF 药物作用机理和 AMD 发病机理与疗效之间的内在关联，有必要筛选一些具有潜在疗效预测价值的生物标记物，对它们进行检测和分析，并逐步应用到临床实践，为今后 KH902 的临床试治疗供实验依据。我们拟定从影响 AMD 发生和发展的基因、因子以及眼科检查技术等入手，康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 4 OF 16筛选一些具有预测 KH902 疗效或并发症

5、潜力的生物标志物和检测技术。3.2.1 补体系统 补体通过经典和旁路途径活化。经典途径由免疫复合物刺激活化，以补体 C1、C4 、C2 、C3 、C5C9 顺序发生连锁反应，旁路途径由微生物和多糖活化，不需经过 C1、C4、C2，在 B 因子参与下直接启动 C5C9 连锁反应。补体活化可形成膜攻击复合物(MAC，由 C5bC9 组成)，MAC 具有介导细胞裂解、炎症趋化因子的释放并引导炎性细胞趋化，以及增加毛细血管渗透作用。补体因子 H(Complement factor H, CFH) CFH 是抑制补体活化的调节因子，通过干扰（旁路途径和经典途径）补体活化，促进活化的补体失活，保护细胞避免

6、受补体损害。同时，CFH 也可结合 C-反应蛋白（ CRP ）并抑制 CRP 介导补体旁路活化。CFH 表达在各种细胞表面，包括视网膜、脉络膜和 RPE 细胞，当眼底细胞或全身 CFH 功能受损可引起眼底 CNV 的形成，其机制可能是异常CFH 蛋白降低对补体的调节能力，活化的补体引起细胞裂解，细胞裂解后释放VEGF 和其它一些促炎性因子，这些因子又会趋化炎性细胞，趋化的细胞又会释放大量 VEGF 等促血管生成因子，以上多个病理过程参与 VEGF 的生成，最终导致 CNV 的形成和发展。CFH 功能异常主要病因是染色体突变。染色体 1q32 区被认为是 AMD 易感基因位点， Edwards、

7、Haines 和 Klein 等 3 个研究团队通过对 1q32 区 CFH的 SNP 分析表明在 402 (Y402H) 位置的络氨酸被组氨酸替代后，增加 AMD 的发病危险【Edwards,2005 ；Haines, J.L.2005；Klein ，2005】 。Thakkinstian 等研究也证实了 Y402H CFH 在 AMD 中的作用,表明近 50% 的 AMD 病人的 Y402H基因具有多态性。Laine 研究团队也揭示了突变的 CFH 能减少其结合 CRP 的亲和力和降低抑制 CRP 介导的补体活化能力，最终导致 AMD 发病【Laine, M.，2007 】 。除了 CFH

8、 基因 外，LOC387715 是另一个重要的 AMD 易感基因，它定位在染色体 10q26，其基因的功能还不明确。在德国 2 个不相关人群中进行的连锁分析和其它一些研究揭示，LOC387715 的 rs10490924 SNP 与 AMD 明显相关【Rivera A,2005】 ， 同时，它们之间的相关性也在高加索人【Yang 康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 5 OF 16Z,2006；Yates JR，2007】 、日本人【Tanimoto S，2006；Kondo N,2007】 、俄罗斯人【Fisher SA,2006】和印度人【Inderjeet Kaur，200

9、8】中得到进一步验证。CFH 和 LOC387715 基因突变与 AMD 发病相关，也可能与 AMD 病人抗 VEGF 的疗效有关。从事抗 VEGF 治疗 AMD 的 Kim 医生表示： “越来越多迹象表明不同 CFH Y402H 基因的表达与抗 VEGF 治疗的反应相关” （来自互联网消息） 。为了确定 CFH 基因型是否对玻璃体内注射 lucentis 治疗湿性 AMD 是否具有药物遗传学影响，Lee 等采用回顾性研究对 156 名注射 lucentis 的湿性 AMD 病人进行了研究。通过临床检查、视力、眼底照相、荧光血管造影以及 CFH(Y402H)的单核苷酸多态性分析。结果表明 CF

10、H Y402H 危险等位基因纯化子的病人增加了 37%的追加治疗危险。作者认为根据 CFH 基因型不同，AMD 病人对玻璃体内注射 lucentis 治疗反应也不同，提议检测 CFH 基因型有助于将来湿性 AMD病人疗效的判断【A Y Lee，2009】 。为调查 CFH 或 LOC387715 基因型与湿性AMD 病人对玻璃体注射 Lucentis 的治疗反应之间是否存在相关性， Milam 等人通过回顾性研究对单独用 bevacizumab 治疗的 86 名湿性 AMD 病人进行调查。结果显示具有 CFH TT 基因型的 CFH Y402H 多态性 AMD 病人的 CNV 面积较大(P =

11、 0.02)。治疗后的 CFH TT 基因型病人的视力从 20/248 提高到 20/166， CFH TC 型从 20/206 提高到 20/170，而 CFH CC 型从 20/206 跌至 20/341(P = 0.016)。与 CFH TT 和 TC 型病人的 53.7%的病人视力改善相比，CFH CC 基因型病人只有 10.5% 的视力得到改善，统计分析具有显著性差异(P = 0.004)。 LOC387715 基因型对 bevacizumab 治疗无明显影响 【Milam A，2007】 。补体因子 B (CBF)和补体组分 2 (C2) CBF 与 C2 基因定位在 MHC区，呈

12、基因紧密连锁，其基因突变可导致补体活化功能的异常。CBF 是 C3 激活剂的前体蛋白，是补体旁路途径中的关键因子，它能促进补体活化。而 C2 作用于经典补体途径，是活化途径中的关键因子，其基因突变对 AMD 的发病有抵制作用。Gold et 等检测了 CBF 和 C2 基因， 发现 AMD 病人的 C2 内含子 10 出现 2 个单元型-L9H CBF/E318D C2 和 R32Q BF/a 的突变体，提示了 AMD 病人康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 6 OF 16的补体参与了旁路、而非经典补体活化途径。Maller 等研究显示 CBF 和 C2 的基因部位存在保护性和

13、危险性的单倍型，位于 C2/BFH 基因座最常见的单倍型 H1 可增加 AMD 发病的危险性，属于危险性单倍型，而 H7 和 H10 单倍型对 AMD 有保护效应，属于保护性单倍型【Maller J,2006】,为什么基因突变会出现作用相反的保护性和危险性单倍体还不清楚。Jakobsdottir 等研究表明白种人的 CFB（6p21，GeneID 629）和C2（6p21 ，GeneID 717） ，发现 C2rs547154 与 AMD 显著相关【Jakobsdottir J，2008 】 。Andrea J 等通过血 DNA 分析对 565 名 AMD 美国高加索人病人和204 总种族对照

14、进行了研究，结果显示 AMD 与 C2 rs547154 (IVS10)基因和 CBF 的 rs641153 (R32Q) 明显相关【Andrea J,2008】 。另一些易感基因已被定位在染色体 10q26，被称为 LOC3877 或位于临近的启动区的基因称为 ge HTRA1 【Yang Z,2006】 。与 CFH、CFB 和 LOC3877 HTRA1 突变相关的 AMD 人群归因危险度至少达 50%【Maller J，2006】 。补体组分 3(C3)和 5 (C5) C3 补体经典途径和旁路途径的核心补体，是 C5转化酶的组分，基因定位于 5 号染色体上。C5 是形成 MAC 的第

15、 1 补体分子，基因位于 9 号染色体上。C3a 和 C5a 是补体 C3 和 C5 的活化形式。Mullins 等人发现在 AMD 病人眼底黄斑区中有 C5 和 MAC(C5b9)的存在，在眼底黄斑区、RPE 细胞和 Bruch 膜部位有 C3a 和 C5a 存在【Mullins RF， 2000】 。Ambati 等研究表明眼底的 C3a 和 C5a 可直接或间接（形成的MAC）攻击局部细胞，导致视网膜色素上皮(RPE)等眼底细胞的损伤【Ambati J，2003 】 。Nozaki 和 Ambati 等通过对 AMD 病人和 CNV 动物的视网膜和脉络膜组织检测发现，活化补体能上调局部组

16、织中 VEGF 的表达，其途径可能通过裂解细胞导致和细胞内 VEGF 的释放【Nozaki M,2006； Ambati J，2003】 。Reynolds 等人为评价外周血中补体的活化和调节水平与 AMD 表型或基因型之间的关系，对 58 名干性 AMD 和 62 名湿性 AMD 病人以及 60 名对照进行了研究。结果表明血清中 C5a 和 C3a 的水平与 LOC387715/ARMS2 和 C3 基康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 7 OF 16因型之间相关Reynolds R，2009。除了活化外，C3 和 C5 的编码或调解基因突变后可诱发 AMD 的发生。Yate

17、s 等对 C3（19p13，GeneID 718）和 C5 上的 13 个 SNP 进行了基因扫描，发现在英格兰和苏格兰人群组中 C3rs2230199 (Arg80Gly)与 AMD 均具有显著性联系【Yates JR,2007】 。Dominiek 等为研究 C3 基因与 AMD 之间的相关性，通过基因检测对 6418 名鹿特丹 55 岁以上 AMD 病人的 C3（R102G 和 P314L）基因进行分析。结果发现 C3 的 R102G 和 P314L 等位基因能明显增加早期AMD 和晚期 AMD 各亚类发病的危险。 【Dominiek D.G，2009】 。C-反应蛋白（CRP ） CR

18、P 是补体旁路途径活化物，它不仅是心血管疾病发病的危险因素Tsimikas S，2006，也是 AMD 发病的危险因素，大量文献表明 CRP 参与 AMD 的发病过程。Andrew 等研究揭示血清中 CRP 浓度提高可增加 AMD 的发病危险Andrew K. Vine，2005 。Schaumberg 等在女性 AMD 发病机理研究中,对血液中 CRP、可溶性细胞间粘附分子(CAM-1) 和纤维蛋白原等检测发现上述 3 种蛋白标志物升高可出现在女性 AMD 发病的前期，证实了 AMD 发病与炎症有关的推断【Schaumberg DA，2007】 。Kikuchi 等对日本 AMD 病人研究发

19、现病人CRP 中位数水平显著高于对照组，而且随着 CRP 水平的增加，AMD 发病风险有增加的趋势（P0.01） Kikuchi M,2007。CRP 参与 AMD 形成的机制可能是通过慢性炎症反应导致细胞氧化功能的损伤、玻璃膜疣的形成或 Bruch 膜变性等。 CRP 也能通过诱发补体激活，在 AMD 发生中发挥直接作用。同时，CFHY402H 变异可以降低了 CFH 的结合CRP 的能力，加剧了 CRP 介导的补体损伤作用 Schaumberg DA,2006。Johnson 等研究结果表明 CFHY402H 纯合子能增加 CRP 在脉络膜上的沉积，这种作用可能会促进 AMD 发生和发展J

20、ohnson PT,2006 。 白细胞介素-6（IL-6） ，白细胞介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF-）包括白细胞介素和肿瘤坏死因子等炎性细胞因子在各种视网膜 NV 疾病中起关键作用。 Rojas 等研究显示 IL-6 的表达可诱导视网膜组织中 VEGF 的表康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 8 OF 16达，白细胞的粘附和血管的重构【Rojas M，2009】Campochiaro 对 40 名视网膜静脉阻塞黄斑水肿病人、11 名糖网病黄斑水肿病人、8 名血管新生性 AMD 病人的房水 VEGF 进行分析。结果显示糖网病黄斑水肿房水 VEGF 水平中央静脉阻塞病

21、人分支静脉阻塞病人，注射ranibizumab 后一个月， 39 名中央静脉阻塞或分支静脉阻塞病人中 27 名病人水肿消失。该研究提议房水标本可用于检测疾病进展、药代和药效学研究相关的生物靶分子【Campochiaro PA，2009】 。Roh 等研究了不同病程湿性 AMD 病人玻璃体内注射 Avastin (bevacizumab)后房水中炎性因子浓度变化。结果表明复发组病人房水中 TNF- 和 IL-2 水平明显低于对照组(P 值分别为 0.036 和 0.019)，CNV 活动组 (复发组和初次发病组) 病人房水中 IL-6 和 IL-8 与 CNV 大小相关。该研究表明房水中 IL-

22、2, IL-6, IL-8, 和 TNF- 可能与 CNV 活动相关【Roh MI，2009】 。除 CRP 外，IL-6 和 TNF 受体 2、细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1，以及脂蛋白(a)和载脂蛋白 B 等均属于炎性心血管疾病危险因素。AMD和心血管疾病可共享一些危险因素，Seddon 等为研究上述因素与 AMD 发病是否相关，对 251 名 60 以上的老年人进行研究。结果表明 IL-6 与 AMD 的进展有关。细胞粘附分子 1 和脂蛋白载脂蛋白 B 也表现出促进作用，但没有统计学意义。CRP 和 IL-6 水平与体重和吸烟状态明显相关。该研究表明血液中的CRP 和 IL-6

23、 水平与 AMD 的发生和发展有关【Seddon JM，2005】 。Campochiaro 等对 40 名中央静脉阻塞（CRVO)）或分支静脉阻塞(BRVO)引起的黄斑水肿病人、11 名糖网病黄斑水肿(DME)病人和 8 名血管新生性 AMD (NVAMD)病人的前房水标本进行了分析。结果显示 DME 病人前房中 VEGF 水平明显高于 CRVO 病人的，CRVO 病人的前房中 VEGF 明显高于 BRVOen 病人。第二次注射 ranibizumab 后一个月，39 名 CRVO 和 BRVO 病人中的 27 名病人水肿消失，水肿消退组病人房水中 IL-6、IL-1 和 TNF- 水平不高

24、于未消退组（残留水肿）病人【Campochiaro PA，2009】 。3.2.2 炎症细胞 除了补体和炎性因子外，炎性细胞在 AMD 发病过程也起重要作用。康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 9 OF 16Hageman 和 Penfold 等通过对 AMD 病人眼底组织研究显示 drusen 的形成与炎症有关，巨噬细细在炎症反应中起主要作用【Brantley MA，2007；Penfold PL，2001 】 。 Grossnicklaus 等通过组织学研究也显示了在 CNV 组织中炎症细胞中巨噬细胞占主导地位【Grossniklaus HE，2002】 。由于 AMD 病

25、人的眼组织标本来源困难，Cousins 等研究了 AMD 病人外周血中单核细胞(DC)的功能状态与发病的关系，通过体外分析 DC 表达和分泌TNF- 的能力，显示来自 AMD 组和对照组外周 DC 分泌 TNF- 能力不同，DC 分泌高浓度 TNF- 的病人具有较高 AMD 的患病率，表明外周血中活化DC 可做为 CNV 发病高危险状态的生物标志物【Cousins SW，2004】3.2.3 抗体除了补体、炎性因子和细胞外，抗体也参与 AMD 的发病过程。Patel 通过直接免疫组化和 Western blot 方法对 AMD 病人和对照组人群血清中抗视网膜抗体进行了分析，结果表明 93.75

26、%的黄斑变性和 82.27%的 CNV 病人血清中有明显(P = 0.02)高滴度的视网膜自身抗体，而对照组只有 8.69%的比例出现。表明在 AMD 早期有抗体免疫过程参与【Patel N，2005 】 。3.2.4 VEGF 信号通路蛋白与相关蛋白血管内皮生长因子（VEGF） 是血管新生的主要调节蛋白因子，参与 CNV的形成，与湿性 AMD 的发生和发展密切相关。Roh 等对不同病程 AMD 病人房水中 VEGF 的浓度变化与 CNV 疾病进展关系进行立了分析。结果表明与对照组相比，CNV 初次发病组 (66.8 +/- 35.1 pg/mL)和复发组 (55.7 +/- 63.0 pg/

27、mL) 病人房水 VEGF 浓度明显高于 CNV 退化组 (9.8 +/- 12.8 pg/mL，P 值分别为 0.025 和 0.004） ，表明房水中 VEGF 水平与与 AMD 病人的 CNV 活动密切相关【Roh MI，2009 】 。Campochiaro 等对 40 名中央静脉阻塞（CRVO)）或分支静脉阻塞(BRVO)引起的黄斑水肿病人、11 名糖网病黄斑水肿(DME) 病人和 8 名血管新生性 AMD (NVAMD)病人的前房水标本进行了分析。结果显示 DME 病人前房中 VEGF 水平明显高于 CRVO 病人的，CRVO 病人的前房中 VEGF 明显高于 BRVOen 病人。

28、该研究提议房水标本可用于检测与疾病进展、药代和药效学研究相关的生物靶分子【Campochiaro 康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 10 OF 16PA，2009】 。Tsai 等研究血液中 VEGF 和 NO（一氧化氮）对 AMD 和 PDR(增殖性糖网病)病人 CNV 的影响，通过 ELISA 检测血清中 VEGF，通过化学发光检测了血清中 NO。结果显示 AMD 组病人血清中 VEGF 水平( 平均值为 256.0 pg/ml, 浓度范围为 146.4-375.3 pg/ml)明显高于 PDR 组病人 VEGF (124.8 pg/ml, 75.7-215.3 pg/m

29、l, p = 0.004) 和对照组 VEGF(120.3 pg/ml, 82.8-168.2 pg/ml, p =0.001)。PDR 组病人血清 NO 水平(137.4 microM, 63.7-240.1 mM) 明显高于CNV/AMD 组 (71.8 mM, 42.4-113.3 mM; p = 0.004)和对照组(62.6 mM, 39.0-114.9 mM; p = 0.002)。VEGF 与 NO 的增殖没有相关性，表明血液循环中的 VEGF 和 NO 在 NV 形成过程中可能起不同作用【Tsai，2006】 。除了外周血和房水中 VEGF 浓度与 AMD 相关外，其外周血中

30、VEGF 基因多态性与 AMD 发病有关联。目前 VEGF SNPs 已被用于预测个体发生口腔肿瘤的生物标志物【Ku，2005】和乳腺癌存活预后指标 【Lu ，2005】 。Amanda 等对 45 名湿性 AMD 的 VEGF 基因启动区和编码区 14 SNPs（启动区 8 个、非编码区 1 个和编码区 5 个）进行分析。结果表明 SNP +674 CC 基因型明显与AMD 相关 (OR=2.40, 95%CI 1.095.26, P=0.027)。 对 SNPs +674, +4618, +5092, +9162 和+9512 分析表明 CTCCT 和 TCACC 与 AMD 相关(OR=

31、15.77, 95% CI 1.91130.24, P=0.0161 和 OR=9.95, 95%CI 3.2230.74, P=0.000053)。启动区 SNPs 分析揭示 460T, 417T, 172C, 165C, 160C, 152G, 141A, 116A, +405C 单倍体与 AMD 明显相关 (OR=18.24, 95%CI 2.25148.25, P=0.0074)【Amanda J，2006】 。3.2.5 眼科检查技术OCT 被用于预测 DR(糖网病)的治疗结果，也可考虑用于的预测 AMD 的治疗结果。为预测糖网病玻璃体内注射曲安西龙后视力恢复结果，Gibran 等对

32、 93 名糖网病病人和 25 对照进行了回顾性研究。结果表明较低视网膜内部 OCT 反射率与视网膜的萎缩程度相关，萎缩的视网膜可导致病人治疗后视力恢复的失败，来自视网膜内部 OCT 反射强度可提供客观的标准，去预测糖网病病人对玻璃体内注射曲安西龙的疗效反应（视力恢复） 【Gibran SK，2007】 。通过类推，OCT 也可用于预测湿性 AMD 病人对玻璃体内注射 KH902 的治疗反应。例如，通过 OCT 可诊断息肉性脉络膜血管病（polypoidal choroidal vasculopathy ，PCV)，康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 11 OF 16一些资料研究

33、显示 PCV 是 AMD 病人玻璃体内注射 Lucentis 和 Avastin 失败的常见原因。眼底镜是眼科另一常用的检测设备，可检查眼底荧光和眼底自发荧光（Autofluorescence，AF)，Britta 等为了评价 AF 显像在预测湿性 AMD 抗VEGF 治疗中的诊断价值，对 95 只玻璃体内注射 Bevacizumab 的湿性 AMD 眼进行了分析，结果表明，AF 的差别可代表 RPE 代谢紊乱的不同种类，它们对抗 VEGF 治疗有很大的影响， AF 值高的 AMD 眼对抗 VEGF 治疗，使病人对治疗无明显反应，表现为视力无明显改善【Britta，2008】 。Seungbu

34、m Kang 等报道了玻璃体内注射 ranibizumab 治疗 AMD 有关的 CNV 疾病近 1 年临床结果，目的是识别可影响韩国病人视力恢复结果的预测因素。通过对 60 名（64只眼，玻璃体注射 0.5 mg Lucentis）进行 12 个月的追踪调查，结果表明视力恢复或保持 12 个月稳定的病眼为 71.9%（46/64） ，通过对个亚组病眼分析显示治疗前视力和 CNV 大小影响 Lucentis 治疗结果 (P = 0.039 和 P = 0.042)。研究者提出：治疗前的视力和 CNV 大小可做为 lucentis 治疗后视力恢复的预测因素【Seungbum Kang ，2009

35、 】 。3.2.6 临床调查影响 AMD 发病的环境因素环境因素和遗传因素相结合可影响 AMD 的发病【Antoniak ， 】 。高血压、高胆固醇血症和肥胖症和高脂肪饮食等常见影响心血管疾病的因素也影响 AMD的发生和发展。尽管一些研究提出心血管疾病与 AMD 无相关性。但 Ruth E 等研究显示心血管疾病在老年人 AMD 发病过程中起病原学作用，提出控制血压和胆固醇（经常食用许多饱合脂肪酸可影响视网膜脂类代谢） 、避免吸烟（长期吸烟增加视网膜黄斑变性的机会）和维持正常体重可减少 AMD 发病【Seddon JM，2005】 。此外年龄、遗传因素（AMD 家族史）和职业性光线暴露也是影响A

36、MD 发病的主要因素。Amanda 等对 45 名湿性 AMD 研究发现 VEGF 的 SNPs与 AMD 的发病相关，但吸烟、高脂肪饮食和高血压与 AMD 发病无关，饮食中加入抗氧化剂可起保护作用【Amanda J，2006】 。病人的问诊在预测抗 VEGF疗效可能起参考作用，Seungbum Kang 领导的韩国一个研究小组对 60 名 CNV康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 12 OF 16病人的 64 只眼（玻璃体注射 0.5 mg Lucentis）进行 12 个月的追踪调查，通过对病人的视力恢复程度、性别、年龄、CNV 大小和类型、以及是否伴有全身疾病和光动力治疗

37、等数据进行了比较分析。结果表明病人性别、年龄、CNV 类型、以及无全身疾病和先前进行的光动力治疗对治疗结果无影响【Seungbum Kang，2009】 。4. 检测指标4.1 外周血考虑临床房水标本来源困难，本设计针对血液检测，检测标本包括细胞和血清，检测指标包括细胞活性分析、视网膜抗体、CRP 和基因多态性，检测技术包括 ELISA/化学发光、细胞培养，以及 PCR 和电泳等。4.1.1 血清检测（按重要性排序） VEGF（含 PlGF）: 外周血或房水中 VEGF 浓度与湿性 AMD 发病和 CNV面积相关，拟通过 ELISA 法检测外周血 VEGF 浓度水平。 CRP:外周血和玻璃体内

38、 CRP 与湿性 AMD 发病明显相关，拟采用 ELISA方法分析外周血中 CRP 浓度。 视网膜自身抗体：外周血中抗视网膜抗体与湿性 AMD 发病相关，拟采用ELISA 方法分析血清中抗体浓度。 IL-6: 血液和房水中 IL-6 浓度与湿性 AMD 发病和 CNV 面积相关，拟采用ELISA 分析血清中 IL-6 浓度。 TNF-a：与 AMD 的复发等，研究者多检测房水中 TNF-a，本研究拟检测外周血中 TNF-a。4.1.2 基因多态性（按重要性排序） CFHY402H 基因多态性：通过荧光 PCR（Taqman MGB，需多通道的荧光定量 PCR）或测序分析方法检测病人的基因表型。

39、 VEGF 基因多态性分析：VEGF 质和量与湿性 AMD 发病相关。血液中VEGF 浓度反映其量的改变，其基因突变反应其质的改变。拟采用单核苷酸多态性和测序方法对 VEGFSNP +674 CC 基因突变进行分析。康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 13 OF 16 CBF 和 C2 基因多态性：拟采用单核苷酸多态性技术分析单倍型 H1（危险性单倍型）以及 H7 和 H10 单倍型（保护性单倍型） ，还包括 C2 rs547154 (IVS10)基因和 CBF 的 rs641153 (R32Q)基因。 C3 基因多态性: 拟分析 C3rs2230199、 C3R102G 和

40、C3P314L。 单核细胞活性：外周血中单核细胞活化状态与湿性 AMD 有关，体外分析细胞分泌的 TNF- 的量，推测病人体内单核细胞的活性状态。4.2 眼科检测OCT 可用于预测湿性 AMD 病人对玻璃体内注射 KH902 的治疗反应。通过检测排除已知的一些可能对治疗无反应的疾病，像息肉性脉络膜血管病等有资料研究显示 PCV 是 AMD 病人玻璃体内注射 Lucentis 和 Avastin 失败的常见原因。眼底镜可检查眼底荧光和眼底自发荧光。 视网膜代谢紊乱的状态可根据眼底自发荧光结果进行推测，AF 值高 AMD 眼可能对抗 VEGF 治疗无明显反应。眼底 CNV 的位置和面积可通过眼底荧

41、光确定，CNV 面积大小可影响抗 VEGF治疗效果。视力丧失程度可影响抗 VEGF 的治疗结果，AMD 病人治疗前的基础视力可通过视力表检测，做为预测疗效指标。5. 可行性分析标本来自病人的外周血，易获得，需临床组配合采血。细胞培养可在公司内完成。困难是需要正常老年血做对照，可考虑不做或委托其他单位完成。血清靶蛋白和抗体可在公司内完成，需要视网膜组织标本和购买相应的试剂。基因型的检测可在公司内（测序法）或与其它单位合作完成（多色荧光 PCR 或其它SNPs 检测方法） 。6. 文献A Y Lee,et al.Pharmacogenetics of complement factor H (Y4

42、02H) and treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab.Br J Ophthalmol 2009;93:610-613Amanda J. Churchill, James G. Carter1, Helen C. Lovell1,et al.VEGF polymorphisms are 康弘生物康弘生物 报告编号： 密级：绝密 PAGE 14 OF 16associated with neovascular age-related macular degeneration.Human M

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