1、聚合酶链反应在幽门螺杆菌感染中的新进展来源：中国论文下载中心 07-08-31 16:48:00 作者：未知 编辑：studa20关键词： 聚合酶链反应 幽门螺杆菌感染 发现幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp ）至今已有十多年，在这十多年期间对 Hp 的研究进展飞速，已从细胞水平逐渐深入到分子水平。现在认为 Hp 是胃炎，消化性溃疡的主要致病因素，而且与胃癌有密切关系。Hp 本身的螺形，鞭毛结构及其分泌的细菌毒素，空泡毒素，尿素酶，粘蛋白酶，过氧化氢酶，磷脂酶，热休克蛋白，低分子趋化性蛋白质粘附素等都与其致病相关。诊断 Hp 感染已从传统的细菌学，免疫学手段发展到分子生物
2、学方法，尤其是通过分析 Hp 核酸，已清楚Hp 的部分核苷酸序列，这为聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于Hp 研究创造了条件。本文就近年有关 PCR 在 Hp 研究中的应用作一综述。1 PCR 原理PCR 是近年发展起来的一种体外扩增特 DNA 片段的技术，有关它的原理许多文献已有详细介绍，这里只作简述 PCR 的每次扩增循环包括三步，第 1 步为变性，在高温下把双链靶 DNA 拆开；第 2 步，在较低的温度下使引物与靶 DNA 互补；第 3 步在中间温度下，在 DNA 多聚酶作用下，引物按模板 DNA 延长，典型的PCR 包括 3050 循环，如此
3、重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增，在PCR 操作中，有几点必须考虑。选择引物长度以 1530 个碱基为宜，太短特异性不佳，太长不增加特异性而合成费用增加。引物中应尽量避免单高重复的核苷酸结构，同时还要考虑引物本身的物理特性，避免经物自身退火。反应的退火温度慎重选择，温度高可提高特异性，但敏感性隆低，温度低则反之。2 引物选择2.1 尿素酶基因核苷酸Hp 分泌大量的尿素酶，该酶是导致哺乳动物对 Hp 产生免疫应答的重要抗原，可能是 Hp 的重要致病因子之一，因此许多学者采用尿素酶核苷酸序列中的部分片段作为引物。Clayton 等报告了 Hp 尿素酶基因（ureA 和 tureB）的核苷
4、酸序列，筛选到 ureA 和 tureB 两个亚单位，并测得了它们的核苷酸序列。目前有代表性的采用以尿素酶部分核苷酸顺序为引物对的有：Clayton 采用一对 18 个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导扩增后的 DNA 产物为 411 个碱基对。其他学者都是以 Clayton报告的 Hp 尿素酶基因的部分核苷酸序列为依据而设计 PCR 的引物。Courcoux 等选择尿一纱酶 C 基因中的一段 294bp 作 PCR 反应。2.2 16S rRNA 核苷酸顺序所有细菌的 rRNAs 根据其大小分为三种：含 120 个核苷酸的 5s rRNA；含1600 个核苷酸的 16S rRNA 及含 300
5、0 个核苷酸的 23S rRNA。分析细菌 16s rRNA现已作为细菌分类的一个指标。大量研究证明，Hp 的部分 16s rRNA 与弯曲菌属细菌显著不同，目前采用以 16S rRNA 部分核苷酸顺序为引物的主要有 Ho 等，采用一对 20 个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导扩增后的 DNA 产物为 109 个碱基对。有些学者用 PCR 拉增 Hp 及与其相类似微生物的 16s rRNA，以此来识别H.pylori，H.mustelac 和 H.canis。2.3 编码 Hp 特 6kD 蛋白质的核苷酸OToole 等报告 Hp 提取物中大量的 26000 蛋白质，作者提出此蛋白质是 Hp
6、特异蛋白质，并分析编码该蛋白质核苷酸序列。Hammar 等以此为依据，设计一对 23个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导拉增后的 DNA 产物为 298 个碱基对。2.4 其它Valentine 等从基因库中选出 1.9kd 的 DNA 片段作为探针，与 19 株 Hp 反应都为阳性，与 32 种 306 株其它细菌均无反应，其特异性为 98.7，假阳性是由于载体污染。由此作者从 1.9kdDNA 中的已知 288 个碱基片段中选出一对 20 个寡核苷酸链为引物，其特异引导扩增后 DNA 产物为 203 个碱基对。纵观不同学者选出的引物，这些引物都能特异地以 Hp 的 DNA 为模板，扩增Hp
7、的部分核苷酸，而不引导扩增其它细菌的核苷酸。3 应用3.1 临床诊断自从成功分离出 Hp 以来，由于 Hp 感染在临床上的重要性，迫切需要一个快速敏感检测检测标本的方法，学者们在不断探索各种诊断 Hp 感染的方法。传统的培养方法由于细菌生长要求高，死亡或菌量过少，则常规方法难以检出，其它方法如同位素标记的二氧化碳呼气试验，费用贵，快速尿素酶试验由于制剂标准不统一，消化道其它一些细菌也产生尿素酶，使该方法的特异性受到影响，检测抗 Hp 抗体方法简易，但很难区分是否为近期感染，随着分子生物学技术不断发展，最近有些实验室采用 PCR 技术诊断 Hp 感染，取得满意结果，Ho 等采用 16s rRNA
8、 的部分核苷酸序列为引物，其引物不引导拉增与 Hp 的 16S rRNA 十分相近的H.cinaedi，H.mustelac ，H.hepaticus 和产生琥珀酸沃林氏菌。检测 10 份已知 Hp 阳性的病理切片都为阳性，另外 4 份胃粘膜活检标本符合已知结果并且能检测到不能培养的 Hp 圆球体的 DNA，进一步测试从猪，狒狒和猴胃中分离的细菌，并用内部探针与扩增的 DNA 产物杂交，提示从这些动物中分离的细菌都为Hp。Engstrand 等选用的 16s rRNA 引物顺序与 Ho 者不同，作者采用了反向转录PCR 技术，先利用反转录酶合成 RNA，然后再扩增 cDNA。其敏感性比常规 P
9、CR提高 2550 倍，可检测到 2 个细菌，检测 15 份标本，14 份标本与呼气试验和培养相同，该方法的特异性为 100，Nguycn 等用该方示检测口腔齿斑标本，18 例Hp 阳性病人中有 7 例阳性，7 例未感染 Hp 病人中，口齿斑未测到 Hp，该结果提示口腔很可能是 Hp 除胃以外体内另一居留地，这也可能是有些病人抗 Hp 治疗后复发的原因之一。Clayton 等采用 urcA 基因的部分核苷酸序列为引物，与 50 株已知 Hp 反应全部为阳性，与产琥珀酸沃林氏菌，空肠弯曲菌，结肠弯曲菌及螺旋菌属（Helicobacter）中另一产尿素酶的细菌 H.mustelae 反应都为阴性。
10、作者除了直接检测胃粘膜外还检测了石蜡包埋病理切片，效果较理想。台湾学者设计了重叠PCR。作者选用了两对以尿素酶基因的部分核苷酸序列为引物，当第一对引物的PCR 循环结束时，将其拉扩增后的 DNA 产物再进行第 2 对引物的 PCR 循环，其敏感可提高 100 倍，而无假阳性。作者分析了两例扩增后 DNA 产物的部分核苷酸序列，在 183 个碱基对中与已报道的尿素酶基因序列有 98的同源性。Hammar 等采用了编码 Hp 特异蛋白质的部分核苷酸序列为引物，27 例胃粘膜标本中，19 例PCR 阳性，而在所有 PCR 阳性标本中只有 15 例培养阳性，另外唾液杯本有 9 例阳性。Valcntin
11、c 等还检测了胃液标本，在 13 例胃粘膜活检阳性标本中，有 11 例胃液标本阳性，而采集胃液比采集胃粘膜方便，只需鼻胃管即操作，对那些不易做胃镜的病人和儿童可能是一个比较易被接受的检测方法。Zwet 等检测了 24 例 Hp 感染病人的粪便标本，12 例于胃镜检后进行，另外 12 例于奥美拉唑治疗 2 周后进行，24 例 Hp 感染阳性者粪便经 PCR 检测均未发现有 Hp 的 DNA 存在，因此得出结论，在发达国家中，Hp 经粪一口途径播的发生率非常低，Levinsteir 等也得到同样的结果。转贴于 中国论文下载中心 http:/热 门 关 键 词经济学 法学 财政税收管理学 论文 考试
12、大医药学 理学 计算机社会学 政治 工商管理教育类 考试 英语论文艺术类 工学 会计审计应用文 文学 证券金融写作指导 英语听力当前位置：中国论文下载中心 医药学 医学 正文聚合酶链反应在幽门螺杆菌感染中的新进展来源：中国论文下载中心 07-08-31 16:48:00 作者：未知 编辑：studa203.2 流行病行学研究目前开展周密细致的 Hp 流行病学研究还有一定的困难，如 Hp 感染的传播途径，Hp 治疗后病人复转阳性是复发还是再感染等等，主要是缺乏准确可靠，方便，易于重复的细菌学分型方法。Hp 的生物学分型，血表学分型方法都有报道，但效果不理想。在分子平上，Hp 全菌可溶性蛋白在聚丙
13、烯酰胺凝胶电泳图谱上表明很大的一致性；用核酸内切酶酶切 HpDNA 的指纹法显示很大的差异性，但是其酶切图谱复杂结果较难解释。PCR 作为流行病研究的工具，其敏感性远远超过其他方法，因而有利于确定细菌感染的来源和途径，如检查环境或动物传染源。目前PCR 技术用于 Hp 流行病学研究有：3.2.1 酶切 PCR 扩增后的 DNA 产物最早由 Langenberg 等报告了用 Hind 限制性内切酶分析 Hp 全基因的差异，Clayton 等用各种核酸内切酶酶不同 Hp 引物引导扩增后的 DNA 产物，发现了Sau3A，Hac ，Msp和 Alu 效果较好，17 株 Hp 都有其特异的指纹图。36
14、 例抗 Hp 治疗前后调查结果显示：抗 Hp 治疗失败是由于细菌持续感染，Foxall 用核酸内切酶 Hac 酶切 PCR 扩增后的部分尿素酶内切酶基因 DNA，22 株临床标本有 10 种图谱，其中 2 种图谱分别包括 5 株和 6 株细菌。Tonodatsu 等用 Hac 酶切PCR 扩增后的部分悄素酶 基因，用 Southern blot 分析 98 株 Hp 得出：不同菌株即使经过保藏和多次传代后，其 Southern blot 图谱仍无改变，因此认为用尿素酶基因作为 DNA 指纹法的探针可用于 Hp 感染的流行病学示踪方面。Moorc 等用核酸内切酶 Hind 内切 PCR 扩增后的
15、部分尿素酶基因 DNA，把 21 株细菌又可分为 4组；如用核酸内切酶 Alu 和 Pvu 酶切，21 株细菌又可分为 15 组，用核酶内切酶 Sau3A 内切同组的 Hp 基因 DNA，其酶切图谱截然不同，提示不是相同株，比较抗 Hp 治疗后细菌酶切图谱，2 例病人相同，1 例病人不同，表明前者在治疗前后感染两种细菌，用核酸内酶酶切 PCR 扩增的 DNA 产物，其图谱比酶切细菌其因DNA 图谱简单，易于分析，而且前者可直接采用胃粘膜标本处理，易于操作。3.2.2 RAPD 和 RFLPRAPD 技术是九十年代初由 Wilions 等最早报道的，RAPD 是 random amplificd
16、 polymorphicDNA 的英文字母缩写，也有 文献称之为 AP（Arbi-trary primer）PCR。它的原理是采用随机选出的单一核苷酸链为引物，以靶 DNA 为模板，在多个部位引旨扩增 DNA。PAPD 结果为细菌株的特异性，故用此主法可区别同种细菌的不同株。Akopyanz 等报道用 RAPD 分析 Hp 以选择较短（小于 10 个碱基对）的寡核苷酸链为引物为佳，一般不超过 11 个碱基对，并且引种的 GC 百分含量必须大于 60，而小于 50效果不甚理想，作者用 RAPD 技术分析了同一医院中分离到的 60 株 Hp，每株细菌的 DNA 图谱有很大的差异，追踪调查 3 例治
17、疗病人，其治疗前后 RAPD 图谱完全相同。RFLP 是 restriction fragment length polymorphism 的英文缩写，它的原理是设计一对（数对）适当的引物，使扩增片段包含某一个或数个多态性的限制性内切酶识别序列。PCR 后，用该限制酶酶切 PCR 产物，根据电泳后酶切片段长度的变化，即可做出诊断。Owen ，Fujimoto 等用以 PCR 为基础的 RFLP 比较了尿至少酶基因与 rRNA 基因图谱的差别，提示从尿素酶基因图谱可知：众多 Hp 培养物是包含有多种基因亚型的 Hp 混合物，因此得出结论，尿素酶基因图谱完全根除所引起的可靠手段。Nancy 等也报
18、道了用 RELP 从一个病人体内检测出不止一种 Hp 菌株。3.3 Hp 分子遗传学研究PCR 还可用于细菌的基因分离，克隆，致病因子基因的序列分析等方面的研究。Courcoax 等选择尿素酶 C 基因中的一段 294bp 对 38 例患者标本标进行 PCR，扩增产物分别测序，结果所有标本在基因水平上均呈现出多态性，无一例核苷酸序列完全相同的标本，88的标本，其 DNA 水平上的改变没有影响相应的氨基酸序列。认为此方法的推广应用或许能够弄清抗 Hp 治疗 4 周后再次出现的 Hp 究竟是复发（recrudescence）还是再次感染（reinfection ）这个问题，并可用于了解 Hp 的传播途径。综上所述，随着分子技术的不断发展，PCR 技术在 Hp 研究中有很大的前途，它具有高效，特异，敏感，快速，简便等优点，标本运输条件不高，甚至可以邮寄，并可作为 Hp 流行病学研究的一种工具，但是 PCR 的高敏感性也可能是它潜在的一个致命弱点，极少 Hp 的 DNA 污染，PCR 过度扩增都可导致假阳性，因此合理选择 DNA 扩增循环次数，实验室布局合理，操作小心谨慎，不污染样品有仔细设置对照等都是不可忽视的因素，通过这些步聚可以尽可能地克服 PCR 潜在的缺点，推动 Hp 的研究进一步深入到分子水平。
