1、1苹果组织培养研究进展摘要：苹果组织培养技术研究取得了较大的突破，本文从苹果组培的几个方面入手，从器官、组织、原生质体及再生体系的建立等综述其研究进展。关键词：组培；再生；诱导 苹果为多年生木本植物, 在遗传上都是杂合体, 由于对控制性状的基因了解较少，使得通过常规杂交育种来培育新品种有一定困难, 特别是改良现有品种的某一两个不良性状更显棘手。本世纪5060 年代开展的植物组织培养技术和70年代后期在植物分子生物学和组织培养基础上发展起来的植物基因工程, 为解决这些困难开辟了新的途径 1。1 离体微繁及其应用1.1 离体繁殖的应用用组织培养的方法加速繁殖新引或培育的品种，可不受季节的限制和影响
2、，可以很容易将一些病原脱除，获得无病毒植株。传统苹果都采用田间种植来保存种质，占地面积大，管理成本高，并容易受炭虫危害，引种或种质交换过程容易携带病虫原，采用组织培养物作为保存物，不仅节省土地、管理方便、也便于国内外种质交流，通过组培技术能够从体细胞和组织再生完整植株。苹果诱变选种多年来一直存在嵌合体现象，利用苹果体细胞胚技术进行突变体选择，将会使突变育种效率提高，同时体细胞胚技术也为研制苹果人工种子奠定了基础。1.2. 苹果直接器官发生型1.2.1 芽茎段、芽体 这两种外植体其上已有芽或胚芽的分化，培养就是使其已分化的芽萌发，长出新梢，其中用茎段培养方法进行苹果优良品种和砧木大规模繁殖已成为
3、常规方法。白桦等（1998）使用苹果“丽红”嫩梢茎段，6月中旬取正在生长的嫩梢，自来水冲洗干净，切成带腋芽的茎段, 70%酒精浸10秒钟, 0.1%HgCl 2 溶液消毒10分钟, 无菌水冲洗5次, 接种时将茎段接触消毒液的切口部分切掉, 外植体长约1cm左右，接种于MS附加BA1.0mg/L培养基上，取得了良好的效果 2，也证明了培养基中添加BA对腋芽萌发的重要性。张巨祥等（1986）在秋天红富士苹果采摘之后, 选取健壮无病成年树徒长枝条, 埋于地下, 冷藏越冬。第二年春天, 取出枝条, 在温室进行催芽。待芽萌动后, 用自来水将枝条冲洗千净, 切成带有12个节的切段, 在95%酒精中浸泡1分
4、钟, 再用0.1%氯化汞液浸泡10分钟, 最后用无菌水冲洗45次, 按常规无菌操作方法，当培养基中IAA浓度为0.3mg/L时，6-BA浓度以2mg/L为最好，300mg/L有利于苗的正常生长, 并可防止玻璃苗的产生 10。1.2.2 茎尖培养2茎尖培养时是先从茎尖长出小芽, 再从芽的叶腋内已有芽原基上长出小芽，腋芽不断形成、不断萌发，从而形成丛生苗，属芽分化的器官型再生方式 4。茎尖培养是大量繁殖苹果苗木及培育无病毒植株的一个重要途径，根据茎尖培养的目的和取材大小可分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型 5。一般茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区内长度不超过0.1mm的范围内，但是在实际操作中
5、大多取得茎尖均会超过这个范围，不可能彻底去除病毒。美国研究苹果病毒始于本世纪40年代初,到1982年全国推广苹果无病毒裁培,英国于4O年末期着手研究苹果病毒病害, 到1982年代末完成苹果无病毒化的普及工作 6。吴国梁等（1990）以“晋光”和“首红”的芽内生长点为材料，接种于MS+ BA1.0mg/L+IBA0.1 mg/L培养基中，短期内获得较健壮植株 8。热处理是苹果获得无病毒原种材料的有效途径之一，武雅娟等（2003）研究了不同品种苹果组培苗热处理对褪绿叶斑病毒、茎沟病毒的脱毒率和影响组培苗脱毒的因素，认为苹果组培苗进行热处理后, 生长高度是决定病毒脱除与否的重要指标，金晕组培苗在热处
6、理期间不分化，单芽生长快, 组培苗长得高, 经检测脱毒率也高 6。1.2.3 成熟胚 幼胚培养离体胚培养在苹果早熟品种育种、克服远缘杂交不亲和性、缩短育种周期及快速繁育无病毒苗木等方面也具有实际意义。石荫坪等用供试苹果金帅、红星、国光、印度和富士，将正常采收的果实经冷藏越冬后, 用肥皂水洗刷, 清水冲洗, 然后用70%酒精棉球多次擦拭,剖开果实, 取出种子, 剥去种皮, 将胚接种在培养基上,分为带子叶和不带子叶两种处理，成功地诱导出多种类型的不定稍及分枝，发现抑制苗与梢生长高度的主要因子是BA的浓度, 在整个育苗的过程首先用较高浓度的BA诱导不定梢及分枝, 然后在低浓度BA的条件下, 使短缩的
7、苗与梢恢复生长，将BA与生长素适当配合 3。发现高浓度BA与低浓度NAA结合诱导了胚芽及子叶叶腋芽的萌发。毋锡金等（1977）以苹果属大果型的金冠、国光、祝光、红星、白粉皮甜黄葵等六个栽培品种，小果型的花红、海棠等两个种为研究材料，接种时先切除果肉的外面部分, 然后按一般方法消毒灭菌, 在无菌条件下解剖出胚乳和胚, 将胚乳进行单独培养, 少量种子的胚乳连同幼胚一起种植，在MS附加BA0.11mg/L+NAA0.010.5 mg/L的培养基上诱导“金冠”，得到胚乳植株，在MS附加BA13mg/L、NAA0.5mg/L的培养基上诱导金冠、祝光和黄太平幼胚下胚轴及子叶基部产生芽丛 9。1.3 外植体
8、经由愈伤组织途经诱导再生由外植体诱导产生愈伤组织, 再由愈伤组织诱导再生不定芽或不定胚的方式也是苹果组织培养中诱导再生的一条重要途径。目前已能从多种外植体诱导出的愈伤组织上分化形成不定芽或不定胚。吴国梁等把消毒好的叶柄切成0.5cm的小段接于培养基上，光下培养一周后开始在切口处长愈伤组织，随后，整个外植体变成为一个愈伤组织团，转到培养基中接种。1.3.1 器官发生途经叶片是诱导愈伤组织再生的一种常用起始材料，苹果叶片的间隙大，易由细胞诱导分化出不定芽。叶片再生植株是由叶脉维管束薄壁细胞或维管束附近的叶肉细胞分裂后直接分化而来，在叶片培养取材叶段或叶圆片时，应切取带有叶脉，特别是带有叶主脉的片段
9、，以提高器官发生与分化频率 11。最早诱导叶片植株是1983年的Liu等, 试材为“金冠”实生苗叶片，在MS附加BA10mg/L、NAA3mg/L的培养基上诱导少数叶片形成不定胚。赵政阳等（1992）以“金矮生”、“秋富1号”、“长富2号”、“乔纳3金”、“岩富1号”、“嘎拉” 和“北斗”叶片为试材，发现植株再生率和再生叶块的再生植株数最多的品种为北斗, 其次为嘎拉, 再次为岩富1号、乔纳金、长富2号，秋富1号、金矮生最差。诱导叶片再生植株的适宜BA、TDZ、NAA浓度分别为2.5mg/L、0.51.0mg/L、0.2mg/L，叶片暗培养最适时间为15天。但本试验仅为单因素试验。吴雅琴等（20
10、06）以昌红苹果组培苗为试材，新梢顶部13节新展开的叶片作为外植体, 分别接种在分化的培养基上, 黑暗处理15天, 昌红苹果叶片不定芽的最高再生率为100%。研究发现与BA 相比, TDZ更适于昌红苹果离体叶片再生, 培养基中添加适宜浓度的TDZ, 可获得较高的再生率。当TDZ浓度为1.0mg/L, NAA0.5mg/L时, 再生效率显著提高, 叶片平均再生率可达100% , 再生叶片平均出芽率为21左右。但TDZ再生的芽呈簇状, 茎难以伸长, 不如BA 再生的芽健壮，将TDZ再生的芽转入含BA的培养基中，芽的状态就恢复正常 12。这个结果与王关林的结论是一致，王关林等（1992）以新乔纳金叶
11、片为试验材料，交替使用分别含TDZ和BA的培养基, 可显著提高其再生芽效率，和BA相比适宜于苹果叶片再生芽的TDZ的浓度范围很宽 13。1.3.2 胚状体发生途经苹果离体叶片再生过程中能够产生与正常合子胚相似的结构,这种结构称为胚状体,也可称做体细胞胚胎。达克东等（2004）以苹果栽培品种嘎拉为试管苗，研究了苹果离体叶片直接体细胞胚胎发生体系和外植体直接体细胞胚胎发生过程中的形态学特征，苹果直接体细胞胚胎发生过程经历原胚、球形胚、心形胚、子叶形胚、成熟胚等阶段，子叶形胚以前的阶段没有观察到形态学多样性，发育至子叶形胚期的直接体细胞胚胎表现出形态学多样性，分别观察到一子叶胚、两子叶胚、三子叶胚、
12、杯状胚、多子叶胚、畸形胚等，这些类型的胚最终都能发育成正常的成熟胚进而发育成小植株14。臧运祥等（2006）利用乔纳金无菌苗叶片培养，成功地诱导出胚状体并获得再生植株，研究表明乔纳金最佳胚性细胞诱导配方为MS+BA2.0mg/L+IAA6.0mg/L+2,4-D0.3mg/L，黑暗处理以6d，获得胚性细胞, 然后转入MS + BA2.0mg/L培养基上诱导胚状体发生, 诱导率可达96.1% 15。1.3.3 花药培养由于苹果多数品种自花不孕，几乎不能通过杂交得到纯系，以往苹果的杂交育种，都以杂合体品种（系）作亲本, 具有很大盲目性，由花培得到单倍体植株，再进行染色体加倍，获得纯合的二倍体植株，
13、就能在短期内得到各种基因类型的纯系，利用这些纯系进行配合力的测定，找出具有优势的杂交组合, 便可以有预见地获得高产、优质、抗性强的理想品种，使杂交育种的目的性增强。吴绛云（1981）用“黄太平”、“金红” 的花药形成愈伤组织，黄太平得到单倍体植株但金红仅分化小苗一株后死亡。所用的培养基为MS+NAA0.10.5mg/L+BA0.51mg/L+生物素5.0mg/L 21。丁爱萍等（1992）等研究原生质体时采用新红星在四月末采集花蕾，接种到MS培养基上形成愈伤组织后转移到MS+BA0.1mg/L+2.4-D2mg/L的培养基上进行原生质的分离培养 22，MS培养基是进行苹果花药培养较好的培养基，
14、适宜诱导的是单核花药期。2 苹果原生质再生植株原生质体是“无壁细胞”,可以直接摄取外源DNA或细胞器，或利用异种原生质体融合而创造体细胞杂种，直接用于植物的遗传改良 17，在生产应用上具有很大潜力。选择分离原生质体的适宜材料是分离培养原生质体成功的关键，主要包括基因型(种或品种特性) 、材料的类型及材料的生理状态等3个方面。基因型直接影响到原生质体的4分离培养效果。不同基因型分离的原生质体产量及活力差别很大，并直接影响到原生质体再生成株。实生杂交后代及砧木类型较栽培品种易成功 16。苹果(Malus) 原生质体培养获得再生植株的研究从1988年开始已陆续有报道, 但再生基因型相对于丰富的苹果属
15、资源还非常有限, 再生体系之间存在很大的差异，且大多限于苹果种及其变种中的栽培品种或砧木 16。潘激光等（2000）对所供试材料进行原生质体分离培养，叶肉原生质分离：取继代繁殖的试管苗，用解剖刀将新梢顶部3片幼叶切成约2 mm宽的长条(不带叶脉)，加入酶液进行酶解。为提高酶解效果, 加入酶液后放入具棉塞的50mL三角瓶中抽真空20min，以促进酶液能充分进入叶肉组织。使用悬浮培养进行原生质体培养，诱导成功了3种基因型苹果原生质体植株 18。魏国芹等（2009）平邑甜茶、M7、嘎啦和鲁加5号试管苗叶片为试材，研究了影响原生质体分离和培养的几个因素。认为固液双层培养效果较好，最适培养密度为1105
16、个/ml，培养12天原生质体变形，34天第一次分裂，2周分裂35次 19，与潘激光的结果不一致。有关苹果叶片、茎段等器官诱导的愈伤组织和原生质体诱导的愈伤组织在形态、结构及性能上的差异方面目前尚无专门报道。原生质体形成的愈伤组织较器官愈伤组织难分化不定芽 20 ，目前许多苹果基因型的原生质体培养已经获得了愈伤组织，但均未获得再生植株。可见诱导愈伤组织植株再生是原生质体培养成功的关键，也是今后研究的重点 19。3 苹果组培存在的几个问题 3.1 暗处理目前常规的组织培养大都是在一定的光周期和一定照度的光下进行的。植物在黑暗中常表现黄化、组织幼嫩、生长迅速等特点，师校欣等（2004）系统研究了黑暗
17、培养在苹果组培快繁各阶段及叶片再生中的作用，结果表明：接种后初期就进行1周或2周的暗培养，对新红星生长分化不利，而接种后光培养1周、暗培养1周，之后一直光培养的条件分化指数最高，较适于新红星的生长分化。乔纳金经24周暗培养再生效果较好，王林经3周暗培养其出芽数和再生率都达最高值，说明暗培养3周对苹果叶片再生不定芽最为有利。完全暗培养的叶片再生效率虽不是最低，但再生芽黄化、细弱，有待于进一步壮苗培养 23。3.2 苹果苗脱毒苹果病毒病严重影响果品的质量和产量，据报道,在我国不同地区造成的减产达到20%35%左右，韩礼星等（1991）用热处理、微尖嫁接、微尖培养、长期继代组培四种方法，对20多个苹
18、果品种及10余个砧木进行了四种常见病毒病的脱毒效果研究，结果表明微尖培养法效果最好 24。董淑英等（2002）以长富1号和早乔纳金为研究材料，利用茎尖培养、茎尖培养与热处理相结合、二次取尖等方法进行苹果脱毒技术研究，茎尖大小对分化率和脱毒率有很大的影响，发现不同品种适宜分化培养基不同,热处理能显著降低苹果茎尖分化率，但热处理能大幅度提高脱毒率，二次取尖对分化率的影响因品种而异,对长富1号的茎尖分化率影响较大,二次取尖分化率降低了26.4% 25。一般而言，切取仅有一个叶原基的微尖培养法，是脱除苹果病毒的有效方法。在过去的几十年中,苹果叶片培养再生技术已取得了相当大的进展,许多品种都已建立稳定的
19、再生系统,甚至有的已经获得转基因植株,但也存在不少亟待解决的问题。苹果叶片高频率多芽再生体系的建立需进一步研究。许多苹果的不同基因型品种再生效率还很低,如何为这些再生能力较差的品种找出一个容易再生的条件还有待解决 26。5参考文献1 达克东,李雅志,束怀瑞.苹果组织培养及基因工程进展J.落叶果树,1994:91-94.2 白桦,王玉国,短枝型苹果丽红”的组织培养与快速繁殖J.山西农业大学学报,1998,18(2):155156.3 石荫坪,贾元淑,李醒义等.果树试管诱变育种的研究J.山东农学院学报,1982, 1:27-38.4 李文安.植物细胞分化及试管植物,植物生理与分子生物学M.北京科学
20、出版社,1992.37-52.5 陈振光,果树组织培养M.上海:上海科技出版社,1987.6 王际轩,李淑珍,姜淑荣等.苹果组织培养繁殖脱毒病毒效果研究初级J.北方果树,1990(1):6-8.7 武雅娟,齐明东.苹果组培苗脱毒试验J.2003(3)8 吴国梁,陈国秀,苹果茎尖及叶柄的组织培养J.植物生理学通讯， 1990(4):49-55.9 毋锡金,刘淑琼,周月坤等.苹果胚乳愈伤组织的诱导和植株的分化J,中国科学,1977,4:355-359.10 张巨祥,汪婉芳.红富士苹果组织培养快速繁殖研究J.山东农业科学,1986 ,4:28-30.11 胡继金,孔振业.甜橙完整叶片培养芽直接发生与
21、解剖观察J.果树科学,1990 7(2):81-84.12 吴雅琴,赵艳华,李春敏.昌红苹果离体叶片不定芽的诱导及植株再生J.云南农业大学学报,2006 ,21(1):32-35.13 张志宏,景士西等.TDZ 对苹果叶片离体再生不定芽的效应J.植物生理学通讯,1997,33(6):420-423.14 达克东,张松, 臧运祥,吴禄平 ,束怀瑞.苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生的形态学研究 J.核农学报,2004,18(2):118-120.15 臧运祥,孙伟尉,达克东等.乔纳金叶片培养胚状体发生体系的建立J.生物技术通,2006:525-529.16 潘增光,邓秀,章文才.苹果原生质体研究
22、进展.园艺学报,1997,24(2): 239245.17 陈振光,林顺权,凌经天.果树原生质体培养及细胞融合的研究进展J.福建农学院学报,1990 (1):102113.18 潘增光,邓秀新.苹果原生质分离培养及植株再生J园艺学报 2000,27(2):95-101.19 魏国芹,李鼎立,梁美霞等.苹果原生质培养再生愈伤组织j.中国农学通报,2009,25(20):179-186.20 张军科,沈向,曹庆芹等.平邑甜茶叶盘组培再生研究初报J.西北农业大学学报,2002, 28(4): 94-97.吴绛云.苹果花药培养获得单倍体植株J.园艺学报,1981,8:36-37.21 丁爱萍,曹玉芬.新红星苹果原生质体再生绿苗J.园艺学报 ,1992,19(3):267-268.22 师校欣,杜国强,高仪,王彦立等.黑暗培养对苹果组培快繁及叶片再生的影响J2004,27(4):18-21.23 韩礼星,王继世,何永涛,刘沛镇.苹果病毒病的脱毒研究J.1991.8(1):7-12.24 董淑英,位绍文,孙静,于秋华等.苹果脱毒方法的比较研究J.莱阳农学院学报,2002 ,19(2):112-115.25 臧运祥,郑伟尉,孙仲序,达克东.苹果叶片组培再生系统研究进展J .2004(2):15-18.
