1、蝴蝶兰组织培养研究进展（综述）,报告人：康耀海,目录,引言 蝴蝶兰组织培养研究进展 褐化问题 蝴蝶兰组培注意事项,1引言,蝴蝶兰为兰科(Orchidaceae)。蝴蝶兰属(Phalaenopsis spp)多年生热带单茎性气生兰。其茎较短，仅2一3厘米长，叶基生 ；根丛生状，具有气生根;花茎从叶丛中抽出，总状花序或圆锥花序;花期为每年的3一4月，花色艳丽，姿态优雅，为著名的观赏花卉(刘金等，1998)。由于蝴蝶兰是单茎性植物，很少生长侧芽，所以无法进行传统的分生等无性繁殖。目前生产中广泛应用的蝴蝶兰的繁殖方式主要是种子的无菌播种及组织培养。,2 蝴蝶兰组织培养研究进展,在国内，对蝴蝶兰的研究起
2、步比较晚，研究水平相对也较落后，基本上是基于国外研究的基础上进行的研究。目前主要有3条途径：一是无菌播种再生途径 ；二是原球茎再生途径；三是丛生芽途径 。,2.2原球茎(protoeorm)途径,关于兰花圆球茎繁殖方面的研究最早开始于国外的20世纪60年代左右，而国内在此方面的研究多数是建立在国外的研究结果之上的，而且研究水平也相对落后。最早是王怀宇(1989)对蝴蝶兰杂交种黄花系和红花系试管苗的茎头、茎段、嫩叶片进行了诱导圆球茎的研究，所用的诱导培养基是Ms+BA3.omg/L茎段的总诱导率为8.8%，叶片的总诱导率为6.3%。,彭立新(1999)等对蝴蝶兰幼叶诱导圆球茎进行了研究，诱导率可
3、达23%。刘福林等(2001)则研究了花梗的组织培养过程，原球茎诱导率达77%。根据已报道的情况可知，蝴蝶兰组织培养诱导圆球茎的材料来源比较广泛，主要有茎尖、茎段、幼叶、根尖、种胚、花梗切片等。,关于圆球茎诱导过程中，基本培养基的选择及外源激素的配比，国内外的研究文献也比较丰富。目前，关于蝴蝶兰诱导圆球茎的基本培养基的筛选中，主要以MS、 1/2MS和KC的研究为主，其中MS基本培养基是较常用的，适用于诱导和增殖等阶段，均有不错的效果(李进进等，2000)。也有人研究了其他不同的培养基类型，认为采用G3培养基、KC等位基本培养基时，对于蝴蝶兰的某些品种，圆球茎的诱导和增殖效果更好(曾宋君等，2
4、000)。所以，基本培养基的选择应该依据不同蝴蝶兰的品种特性来确定。一般来说，查阅有关蝴蝶兰诱导圆球茎的主要资料报道，通常都以MS为基本培养基。,关于蝴蝶兰诱导圆球茎的外源激素的研究中主要有以下内容，通常用的的细胞分裂素种类主要是6一BA，而生长素则主要以NAA为主。国外专家Seenit Uatha(1992)研究认为，6一BA是兰花组织培养中诱导叶片生产圆球茎状体的关键因子，国内学者马杰(2005)在蝴蝶兰诱导圆球茎的试验中，验证了这一结论。综上所述，当细胞分裂素一与生长素的比值较高时，有利于兰花圆球茎的诱导和增殖，而当细胞分裂素与生长素的比值较低时，则其分化效果较好。,2.3 丛生芽途径,
5、由于圆球茎途径经过脱分化过程容易产生变异等弊端，国内外学者开始探索不经过愈伤组织，而直接诱导形成丛生芽的繁殖途径，最早的研究出现于1980年左右 。国内关于丛生芽的繁殖途径最初是由王怀宇(1989)、刘荣维(1993)等人提出的，他们以蝴蝶兰花梗侧芽为外植体，进行了营养芽的诱导并取得了成功，其诱导率可达23%，增殖系数达4倍。邵双(2005)也进行了相关的研究，证实以花梗为外植体，进行丛生芽的诱导，不仅诱导率高，成活率高，而且变异小，有利于保持母本性状。,在丛生芽的诱导及增殖阶段，通常都以MS为基本培养基。在激素配比方面，徐云和(2004)报道，随着6一BA浓度的提高，丛生芽增殖率上升，但是这
6、时试管苗的长势却越来越弱，他指出增殖效果最好的6一BA浓度是5.0mg/L，但也有其他研究认为添加12.5mg/L的6一BA试管苗的增殖率最高。实验证明，适当浓度的有机添加物能够促进蝴蝶兰丛生芽的诱导及增殖 。,李军等(2004)在蝴蝶兰丛生芽的增殖过程中发现，丛生芽的切割方式及切割数量对其增殖及生长状况具有一定影响 ，把丛生芽分割成每3一5个甚至更多为一丛时，其增殖效果则较好，这就是蝴蝶兰丛生芽增殖过程表现出来的群体效应。,生根阶段一般以 1/2MS为基本培养基，而激素种类和浓度通常是以丛生芽的诱导和增殖阶段为依据，在此基础上适当降低细胞分裂素浓度，适当提高生长素浓度，从而形成健壮的试管苗。
7、常用的生长素主要以 NAA(0.1一0.8mg/L)为主，也有报道使用 IBA(0.1一l.smg/L)也有较好的壮苗生根效果(鲁雪华等，2002)。培养基中的无机元素、NAA、蔗糖和多效唑等因素对蝴蝶兰的生根情况有一定影响，林宗铿(2002)等通过正交试验研究发现，影响生根率的主要因素是无机元素，其次是蔗糖，再次是NAA和多效唑;而影响根长的主要因素也是无机元素，接下来是多效唑，最后是NAA和蔗糖。,在培养条件方面，在蝴蝶兰诱导丛生芽的过程中，如何使花梗腋芽转化为营养芽是组培的第一步，研究证明，在14一22的较低温度下，有利于腋芽转化为花芽，而在23一26的较高温度下，则有利于腋芽转化为营养
8、芽。杨美纯(2000)报道，外植体对培养基中营养离子的吸收受到其pH值的影响，当培养基pH值在5.6一5.8时，外植体的培养效果最好;培养室的光照强度对蝴蝶兰试管苗的增殖壮苗及生根均有一定影响，据刘荣维(1993)报道称，当光照强度是3000lx左右时，蝴蝶兰的培养效果最好，然而王怀宇(1989)、陈之林(2003)却得出了不同的结论，认为光照在1500一2000lx的范围时，蝴蝶兰试管苗的生长情况最好。,3 褐化问题,蝴蝶兰的诱导增殖及生根的整个组培阶段，均存在着严重的褐化问题，近年来国内外关于褐化问题的研究主要集中于褐变机理的研究以及抑制褐化两方面。关于植物的褐变机理，有报道称植物体内引起
9、褐变的酶主要是多酚氧化酶 (PPO)，而与其反应的底物是酚类化合物，并且在氧的作用下而发生化学反应生成醌(曾镭，2007)。所以植物培养中出现的棕褐色的物质其实就是醒类物质。它们会逐渐扩散到培养基中，对植物材料造成毒害，影响植物体内其他酶的活性，抑制试管苗的生长及分化，严重时甚至导致材料死亡(吴淑平，2005)。,褐化的过程需要三个必备条件:PPO，氧，酚类化合物。所以如果撤掉这三个条件中的一个条件，则可以达到阻断褐化的目的。目前，研究中常用到的抑制褐化剂主要分两大类吸附剂和抗氧化剂，前者主要包括活性炭、柠檬酸、聚乙烯毗咯烷酮(PVP)等，后者主要有维生素c、谷胧甘肤等。,刘真华(2005)报
10、道称，活性炭是一种广泛应用的吸附性较强的吸附剂，而PVP则是针对酚类物质的专一性吸附剂，二者均可以有效地抑制蝴蝶兰的褐化，但是PVP容易生根，不利于丛生芽的诱导和分生，而谷肤甘肤虽然在抑制褐化方面不如活性炭，但试管苗的生长情况较好。徐传俊(2006)则认为，柠檬酸的抑制褐化效果比活性炭好，他还认为经常更换培养基，以及及时切除材料的褐化部位，均能有效地抑制褐化过程。,4 蝴蝶兰组培注意事项,组织培养的关键程序之一是要从健康、无病毒、性状稳定的植株上获取繁殖材料，在获取繁殖材料的时候一定要进行病毒检测。,蝴蝶兰组织培养中灭菌应当注意以下几个方面 外植体的预处理:将取回的花梗材料，先用75%酒精棉球擦拭一遍，尤其是腋芽部位缝隙等，进行仔细的擦拭，将花梗以每个腋芽为单位切割为3一4cm的节段，在洗洁精液中浸泡10min后，用毛笔蘸着洗洁精液将腋芽部位小心地刷洗一次，最后再在自来水下冲洗 30min后置入超净工作台待灭菌处理。,外植体的灭菌:在超净工作台中，用75%酒精对花梗进行表面灭菌30s后，用无菌水浸洗一次，再用0.1%HgCI2:消毒7一 15min，无菌水浸洗5一6次，用解剖刀将花梗两端接触过HgCI2的部位切去大约lmm左右，按其生长方向接种于灭菌后的启动培养基中，每隔7d观察一次污染情况和萌发情况，30d后统计污染率、死亡率、成活率和褐化率。,
