1、 产品信息和操作指南 Mouse IL-2 预包被 ELISA kit Cat# : DKW12-2020-048 / DKW12-2020-096 本试剂盒专用于科研，而非用于诊断 Mouse IL-2 DKW12-2020 目 录 产品简介 1 知识背景 1 试剂盒提供的试剂 2 需要实验者自行准备的试剂与仪器 2 注意事项 3 试剂的配制 5 操作过程 7 结果分析 9 试剂盒的保存 9 操作步骤一览表 10 参考文献 11 ELISA 测定中可能会出现的问题及解决方法 12 预包被 ELISA 试剂盒系列产品 15- 1 - 1、 产品简介： 达优小鼠 IL-2 ELISA 试剂盒是通
2、过酶联免疫吸附技术， 定量检测细胞培养上清液和小鼠血清、血浆和其他体液中天然和重组IL-2 的浓度。本试剂盒为预包被板， “夹心一步 ”完成，整个过程孵育时间不超过 2.5 小时，洗涤 8 次，操作时间大大减少。本试剂盒专用于科研，而非用于诊断。 使用前请仔细阅读说明书并检查试剂盒组分，若有任何疑问请与达科为生物工程有限公司联系， E-mail： RD. 检测范围： 500-7.8 pg/mL 灵敏度： 3 pg/mL 重复性：板内、板间变异系数均 10。 2、 知识背景： 白细胞介素 -2（ Interleukin-2， IL-2）主要由有丝分裂原或抗原活化的 T 淋巴细胞分泌，是一种多效细
3、胞因子（ 1， 2） 。它在抗原特异的 T 细胞的克隆扩增中起着关键的作用。研究表明，它介导了多种细胞类型的多种免疫反应。- 2 - 3、 试剂盒提供的试剂： 试剂 规格 配制 Cytokine standard 2/1 瓶 * 干粉状，按瓶上说明操作 Biotinylated antibody 2/1 瓶 * 1： 100 用 Dilution buffer R（ 1）稀释 Streptavidin-HRP 2/1 瓶 * 1： 100 用 Dilution buffer R（ 1）稀释 Dilution buffer R（ 1） 3/2 瓶 * 即用型 Washing buffer（ 50
4、） 1瓶 1 50 用蒸馏水稀释 TMB 1 瓶 即用型 Stop solution 1 瓶 即用型 Precoated ELISA plate 812 或86* 即用型 封板膜 2/1 张 * 即用型 说明书 1份 *： 96/48 Tests 4、 需要实验者自行准备的试剂与仪器： 1 酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热） 2 微量加液器及吸头： P10， P50， P100， P200， P1000 3 蒸馏水或去离子水 4 全新滤纸 5 旋涡振荡器和磁力搅拌器 6 37温箱 - 3 - 5、 注意事项： 1. 试剂应按瓶上标签说明储存，使用前 室温平衡 20-30 分钟。实验前室温平
5、衡对 Washing buffer（ 50） 、 Dilution buffer R（ 1） 、 Precoated ELISA plate 和 TMB 有重要意义。 2. 冻干标准品冰上操作，按照标签说明溶解干粉， 充分混匀 ，按照一次使用量分装， -20贮存，避免反复冻融。 3. 预包被板条使用前，请恢复到室温后再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中， 密闭封口 ， 4可保存 1 个月。其余不用试剂应包装好或盖好。 4. Washing buffer（ 50）在 4保存可能有 结晶析出 ，使用前务必使结晶完全溶解后（如加热、平衡温度后混匀等）再配置成 Washing buffer（
6、 1）工作液。 5. HRP 和检测抗体体积量很小，使用前请 高速短暂离心 管子，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。 6. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。 7. 使用前检查试剂盒内各种试剂；试剂稀释、加样和中止反应充分混匀或者摇匀对实验结果尤为重要，最好使用低速频率振荡器或者反应过程中每 15 分钟手工摇匀一次。 8. 实验板孔加入试剂的顺序应一致， 以保证所有反应孔的孵育时间一致。 9. 使用洁净的塑料容器盛装洗涤液。 - 4 - 10. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在 滤纸 上充分拍干， 滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。 11. TMB 对光敏感，避免长时间
7、暴露于光下，避免金属接触影响结果。 有毒，避免用手接触！ 准备使用的 TMB 若变为蓝色，表明 TMB 已经污染，请丢弃。请在终止反应后 10 分钟内读取 OD 值。 12. 请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育。 冬季室内温度偏低，请使用 恒温箱或培养箱孵育 为好。 13. 试剂盒在保质期内使用，且不同批号试剂不要混用。 14. 500 pg/mL 以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。大于 500 pg/mL IL-2 的样品应以 Dilution buffer R(1)稀释后重做。在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。 15. 特异性：不与小鼠其它细胞因子反应。 -
8、5 - 6、试剂的配制： 1. 提前 20 分钟将 Washing buffer(50)和 即用溶液 从试剂盒中取出，以平衡至室温。 2. Cytokine standard： Standard 为冻干粉。先按标签说明将冻干粉溶解，静置 5-10 分钟，再用 Dilution buffer R（ 1）稀释到推荐检测浓度。标准品溶解后混匀，准确倍比稀释，严格操作非常重要。 标准品的倍比稀释最好在进口的或者硅化的 EP 管中完成，减少非特异性吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。母液若没有用完请按照一次用量分装， -20保存。 * 推荐标准品浓度梯度为： 500 p
9、g/mL、 250 pg/mL、 125 pg/mL、62.5 pg/mL、 31.3 pg/mL、 15.6 pg/mL、 7.8 pg/mL。 3. Biotinylated antibody： 1 100用 Dilution buffer R(1)稀释，混匀制成 1antibody 工作液。 4. Streptavidin-HRP ： 110用 Dilution buffer R(1)稀释，混匀制成 1HRP 工作液。 - 6 - 5. Washing buffer(50)： 1 50 用蒸馏水稀释。 6. 即用型溶液 Dilution buffer R(1): 用于稀释 Biotiny
10、lated antibody、Streptavidin-HRP 和 Cytokine standard。 TMB Stop solution - 7 - 7、操作过程： 1. 使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。 2. 根据实验孔（空白和标准品）数量，确定所需的板条数目。样品（含标准品）和空白都应做复孔。 3. 加样 ： 100 L/well 加入稀释后的 Cytokine standard 至标准品孔， 100 L/well 加入样品至样品孔，设置空白孔，用 Dilution buffer R (1)代替样本和标准品。 4. 加检测抗体 ： 50 L/well 加入稀释后的 Bioti
11、nylated antibody。混匀后，盖上封板膜， 37温育 90 分钟。 5. 洗板 ：扣去孔内液体， 300 L/well 加入 1washing buffer；停留 1 分钟后弃去孔内液体。重复 4 次，每一次在滤纸上扣干。 6. 加酶 ： 100 L/well 加入稀释后的 Streptavidin-HRP。盖上封板膜， 37温育 30 分钟。 7. 洗板 ：重复步骤 5。 8. 显色 ： 100 L/well 加入 TMB， 37避光温育 5-30 分钟之间，根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反应。通常显色10-20 分钟可以达到很好的效果。 9. 终止反应 ： 100 L/
12、well 迅速加入 Stop solution 终止反应。 - 8 - 10.读板 ： 终止后 10分钟内， 用检测波长 （ measurement wavelength）450 nm 读值。推荐用双波长即检测波长（ measurement wavelength ） 450 nm 、参考波长或校正波长（ reference wavelength） 610-630 nm 同时读板，测量结果会更准确。 - 9 - 8、结果分析： 1. 有两种设定空白对照的方案： 1) 将 TMB 空白显色孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去空白孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为
13、横坐标。 2) 将零孔设为对照。得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。 2. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。 用户也可以使用各种应用软件来计算。若样品 OD 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 0.00.61.21.82.43.00 200 400 600Mouse IL-2 Concentration （pg/mL）Absorption450 nm9、试剂盒的保存： 4C 可稳定保存 12 个月。 注意： 本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线来计算标本含量。 - 10 - 10、操作步骤一览表： 加 样品 或配好的 标准品 ，设置对照， 100
14、 L/well 加 生物素标记的抗体 ， 50 L/well， 混匀 加 亲和素 -HRP 标记物， 100 L/well 加 TMB 显色液， 100 L/well 加 Stop solution 100 L/well，终止反应 在 450 nm 处读取吸光值 37 温育 90 分钟； 洗 4 次 37 显色 5-30 分钟 10 分钟内读板 37 温育 30 分钟； 洗 4 次 无需温育，直接进行下一步操作 - 11 - 11、参考文献 （ 1） Goldsmith, M.A. and W.C. Greene. (1994) in The Cytokine Handbook, 2nd ed
15、., A. Thomson editor, Academic Press, New York, p. 57. （ 2） Hatakeyama, M. and T. Taniguchi. (1990) in Peptide Growth Factors and Their Receptors I, Sporn, M.B. and A.B. Roberts eds., Springer-Verlag, New York, p. 523. （ 3） 雷甜甜 等 .基础医学与临床 ,2009,29,618-621. （ 4） 黄凯 等 .中国比较医学杂志 ,2009,19 (11),31-35. （
16、5） 张榕等 .中华微生物学和免疫学杂志 ,2007,27 (3):285-287 （ 6） 邱惠 等 .中国免疫学杂志 . 2005,21:918-923. 12 12、 ELISA 测定中可能会出现的问题及解决方法 问 题 可能的原因 解决方法 1非常弱的结果 （ 1）温育的时间或温度不够； （ 2）显色反应时间太短； （ 3）所用配制缓冲液的蒸馏水有问题； （ 4）加入抗体 /酶的稀释液浓度太低； （ 5）酶标仪滤光片不正确；（ 6）不正确的试剂储存方式； （ 7）试剂盒没有充分平衡；（ 8）移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁。 a. 校正温育箱温度； b. 校正定时钟准确定
17、时；c. 使用新鲜合格的蒸馏水； d. 按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液； e. 试剂室温平衡至少 20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约 25）； f. 校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，最好一次性使用。 13 2标准曲线和测定的重复性差 这是典型的由测定操作引起的问题，包括 （ 1）加样本及试剂量不准；孔间不一致； （ 2）加样过快，孔间发生污染；（ 3）加错样本； （ 4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区； （ 5）不同批号试剂盒中组分混用； （ 6）温育时间、洗板、显色时间不一致； （ 7）孔内污染杂物； （ 8）酶标仪滤光片不正确； （ 9）试剂 /样品
18、没有混匀； （ 10）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。 a. 重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近； b. 重复测定标本，操作条件、 人员等应尽可能与上次保持一致， 以排除这些因素造成的不一致的可能性； c. 样品稀释前应充分混匀； d. 尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。 3白板 （阳性对照不显色） （ 1）漏加酶结合物； （ 2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等； （ 3）添加的试剂错误或者被遗漏； （ 4）试剂过期； a. 请按说明书所示稀释倍数配制； b. 注意不要漏加； c. 每次加液前均应核对标签。
19、 14 4空白背景高 （ 1）洗板不干净； （ 2）显色液变质； （ 3）试剂过期； （ 4）不正确的试剂稀释液，如加酶的浓度过高；（ 5）蒸馏水受酶等污染；（ 6）试剂混用； （ 7） 培养箱温度超过 37或反应时间过长。 a. 浓缩洗液准确配制； b. 50 倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释； c. 充分洗涤，彻底拍干； d. 加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染； e. 吸嘴尽可能一次性使用；f. 使用新鲜蒸馏水； g. 不同批号试剂勿混用； h. 请按说明书所示稀释倍数配制； i. 显色反应时间适当缩短。15 13、预包被 ELISA 试
20、剂盒系列产品 达优小鼠 ELISA 试剂盒 DKW12-2000-048 48T DKW12-2000-096 Mouse IFN- ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2011-048 48T DKW12-2011-096 Mouse IL-1 ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2012-048 48T DKW12-2012-096 Mouse IL-1 ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2020-048 48T DKW12-2020-096 Mouse IL-2 ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2040
21、-048 48T DKW12-2040-096 Mouse IL-4 ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2050-048 48T DKW12-2050-096 Mouse IL-5 ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2060-048 48T DKW12-2060-096 Mouse IL-6 ELISA kit （预包被减步法） 96T DKW12-2100-048 48T DKW12-2100-096 Mouse IL-10 ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2120-048 48T DKW12-2120-096 Mouse
22、IL-12 p70 ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2123-048 48T DKW12-2123-096 Mouse IL-12/IL-23 p40 ELISA kit（预包被减步法）96T DKW12-2170-048 48T DKW12-2170-096 Mouse IL-17A ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2220-048 48T DKW12-2220-096 Mouse IL-22 ELISA kit（预包被） 96T DKW12-2710-048 48T DKW12-2710-096 Mouse TGF-1 ELISA kit（预
23、包被） 96T DKW12-2720-048 48T DKW12-2720-096 Mouse TNF- ELISA kit（预包被减步法） 96T DKW12-2734-048 48T DKW12-2734-096 Mouse VEGF-A ELISA kit（预包被） 96T DKW12-2820-048 48T DKW12-2820-096 Mouse IgE ELISA kit（预包被） 96T DKW12-2739-048 48T DKW12-2739-096 Mouse MCP-1 ELISA kit（预包被） 96T 16 达优人 ELISA 试剂盒 DKW12-1000-048
24、 48T DKW12-1000-096 Human IFN- ELISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1012-048 48T DKW12-1012-096 Human IL-1 ELISA Kit （预包被减步法） 96T DKW12-1020-048 48T DKW12-1020-096 Human IL-2 ELISA Kit （预包被减步法） 96T DKW12-1040-048 48T DKW12-1040-096 Human IL-4 ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1050-048 48T DKW12-1050-096 Human IL-5 EL
25、ISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1060-048 48T DKW12-1060-096 Human IL-6 ELISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1080-048 48T DKW12-1080-096 Human IL-8 ELISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1100-048 48T DKW12-1100-096 Human IL-10 ELISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1120-048 48T DKW12-1120-096 Human IL-12p70 ELISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1
26、170-048 48T DKW12-1170-096 Human IL-17A ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1220-048 48T DKW12-1220-096 Human IL-22 ELISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1325-048 48T DKW12-1325-096 Human sIL-2R ELISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1354-048 48T DKW12-1354-096 Human CD54/sICAM-1 ELISA Kit （预包被减步法） 96T DKW12-1406-048 48T DKW12-140
27、6-096 Human CD106/sVCAM-1 ELISA Kit （预包被） 96T 17 DKW12-1530-048 48T DKW12-1530-096 Human Adiponectin/Acrp30 ELISA Kit （预包被） 96T DKW12-1540-048 48T DKW12-1540-096 Human CRP ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1710-048 48T DKW12-1710-096 Human TGF-1 ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1720-048 48T DKW12-1720-096 Human TNF-
28、 ELISA Kit（预包被减步法） 96T DKW12-1730-048 48T DKW12-1730-096 Human GM-CSF ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1731-048 48T DKW12-1731-096 Human G-CSF ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1732-048 48T DKW12-1732-096 Human EGF ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1734-048 48T DKW12-1734-096 Human VEGF-A ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1739-048 48
29、T DKW12-1739-096 Human MCP-1 ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1741-048 48T DKW12-1741-096 Human MIP-1 ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1760-048 48T DKW12-1760-096 Human FGF basic ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1763-048 48T DKW12-1763-096 Human -NGF ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1765-048 48T DKW12-1765-096 Human HGF ELISA Kit（
30、预包被） 96T DKW12-1820-048 48T DKW12-1820-096 Human IgE ELISA Kit（预包被） 96T DKW12-1830-048 48T DKW12-1830-096 Human perforin ELISA Kit（预包被） 96T 18 达优大鼠 ELISA 试剂盒 DKW12-3000-048 48T DKW12-3000-096 Rat IFN- ELISA kit （预包被减步法） 96T DKW12-3012-048 48T DKW12-3012-096 Rat IL-1 ELISA kit （预包被） 96T DKW12-3020-04
31、8 48T DKW12-3020-096 Rat IL-2 ELISA kit （预包被减步法） 96T DKW12-3040-048 48T DKW12-3040-096 Rat IL-4 ELISA kit （预包被） 96T DKW12-3060-048 48T DKW12-3060-096 Rat IL-6 ELISA kit （预包被） 96T DKW12-3100-048 48T DKW12-3100-096 Rat IL-10 ELISA kit （预包被减步法） 96T DKW12-3170-048 48T DKW12-3170-096 Rat IL-17A ELISA kit （预包被） 96T DKW12-3710-048 48T DKW12-3710-096 Rat TGF-1 ELISA kit （预包被） 96T DKW12-3720-048 48T DKW12-3720-096 Rat TNF- ELISA Kit （预包被减步法） 96T ELISA 辅助试剂 DKW12-T010 TMB (ready-to-use，即用型 ), 1 plate 10 mLDKW-F1 ELISA 辅助试剂盒 96T 深圳市达科为生物工程有限公司 Dakewe Bioengineering Co., LTD （ 130101）
