1、粪便钙卫蛋白检测试剂盒 （ 酶联 免疫 法） 货号 EK-CAL 96T EK-CAL2 192T 用途： 瑞士 B HLMANN 公 司 生 产的粪 便 钙卫 蛋 白检 测试 剂盒（酶联免疫法） 用于定量 检测人粪便中的钙 卫蛋白（ MRP8/14; S100A8/S100A9）。 产品原理 本 试 剂 盒应 用 双 抗 体 夹 心法 ， 基 于 不 同 位 点 的 两 种 单克隆抗 -人 钙 卫 蛋 白 抗体 。 标 准品 、 质 控 品 和 稀 释 后 的待 测样本加入到具有高亲和 力的单 克隆抗 -人 钙 卫 蛋 白 抗体 包 被的微孔板微孔内。 在第一次孵育步骤中， 样本中钙卫蛋白
2、被固相抗体捕获。 加入酶联物后第二次孵育时， 形成以下复合体： 捕获抗体 -人钙卫蛋白 -酶标抗体结合物。 接着加入 TMB底物进行显色， 加入酸液终止液终止显色反应， 溶液变成黄色。 黄色亮度与样本中钙卫蛋白浓度成正比。 最后在酶标仪450nm 波长处测量吸光度 。 做出标准品浓度对相应 OD 值的标准曲线，在其上计算出样本浓度。 试剂成分： 试剂 量 编号 说明 提取缓冲液 3 瓶， 125ml B-CAL-EX 直接使用 微孔板 （预包被钙卫蛋白单克隆抗体） 12*8 孔 B-CAL-MP 直接使用 封板膜 3 张 浓缩洗涤液（ 10X） 含防腐剂 1 瓶， 100ml B-CAL-WB
3、 用 900ml去离子水稀释 孵育缓冲液含防腐剂 2 瓶， 125ml B-CAL-IB 直接使用 标准 品 1,2 5 支， 1ml B-CAL-CASET 直接使用 质控品 高值 /低值 2 支， 1ml B-CAL-CONSET 直接使用 酶联物 1 支， 12ml B-CAL-EL 直接使用 TMB 底物 B-TMB12 直接使用 终止液 B-STS12 直接使用 1 钙卫蛋白标准品从 A 到 E 的实际浓度为 4,12,40,120 和240ng/ml。 使用低范围检测程 序时 （样本用提取缓冲液 1:50倍稀释，提取物再用孵育缓冲液 1:50 倍稀释 ， 共稀释 250倍） 标准品
4、 钙卫蛋白 分析浓度分 别为 10,30,100,300,600ug/g。如使用扩展范围检测程序时（样本用提取缓冲液 1:50 倍稀释，提取物再用孵育缓冲液 1:150 倍稀释，共稀释 750 倍）标准品钙卫蛋白分析浓度分别为 30,90,300,900,1800ug/g。 2 标准品和质控品在检测时直接使用，无需稀释。 根据需要可由供应商 提供 的试剂 粪便提取设备 Smart-Prep 50 支 B-CAL-RD Schebo Quick- Prep 50 支 B-CAL-SOFI 1.3ml，直接使用 试剂储存条件和效期 未开封试剂 2-8 度储存，失效期标注在试剂盒标签上，不要使用超过
5、失效期的试剂盒 已开封试剂 提取缓冲液 2-8 度储存，直至失效期 微孔板 未 使 用 的 板 条 立 即 重 新 放 回 装 有 干 燥剂的铝箔袋中，并封上自封口。 2-8 度储存，直至失效期 已 稀 释 的 洗 涤液 2-8 度储存，最多 6 个月 孵育缓冲液 2-8 度储存，直至失效期 标准品 质控品 酶联物 TMB 底物 终止液 需要但没提供的材料 抽 提程序 10ul 一次 性接 种环 (Sarstedt: 86.1562.010) 15ml 带帽 聚丙 烯管 (Sarstedt: 62.554.502) 层流工 作站 多管旋 涡混 合器 精密天 平 (10 - 150 毫克 ) 小
6、型离 心机 （ 3000 g） ELISA 程序 10、 100 及 1000ul 移液器及配套吸嘴 用于样本稀释的一次性试管 用于稀释洗涤液的 1000ml 量筒 用于洗板的洗板机或塑料挤瓶 吸水纸 酶标仪（ 450nm） 注意事项： 安全措施 试剂盒内的微孔板、标准品和校准品还有人源性成分，尽管已经过检测， HBV 表面抗原、 HCV 以及 HIV1/2 均为阴性，但仍然应视为 有潜在 传染性的物质对待， 遵守实验室规程并采取适当的防护措施。 底物和终止液： TMB 底物还有联苯胺、 H2O2 以及二甲基甲酰胺，终止液含有硫酸（ 0.25M），这些试剂都会刺激眼睛、皮肤和黏膜，避免试剂接触
7、眼睛、皮肤并穿着合适的防护服、手套、和眼镜。如试剂接触到眼睛和皮肤，应立即用清水冲洗。 未使用的溶液 必须按当地法规进行处理。 技术措施 试剂盒组件 不要使用超过标签上所示有效期的试剂盒 不 要混合不同批号的试剂 避免试剂、样本和孔间的交叉污染 使用前将试剂恢复到室温并混匀 微孔板不可重复利用 提取 为了获得准确的定量结果，必须将加入到提取缓冲液中的已称重的所有粪便样本变成匀浆。要 避免 样本残留在管帽处。 样本提取时最短需要 5 分钟可获得 有浑浊 的 液体 ， 延长离心时间可以减少或消除浊度，但试验表明浊度对 ELISA 的定量结果无影响。 ELISA 过程 为获取可重复的准确结果，清洗步
8、骤是必不可少的。洗涤液加入到每个检测孔后，每次必须至少孵育 20 秒，洗板次数也要按照要求进行。 如使用自动洗板机，强烈建议使用“板模式”，可缩短孵育时间。 检测板震荡参数： 400-600 转 /分（ 10HZ）。 建议标准品、校准品和标本做复孔，每次 实验 都必须使用 本次 新 做 的标准曲线。 如果某个未知样本的检测到的浓度比最高的标准品浓度还要高，则需要将这个未知样本进一步稀释并重新检测，由此产生的稀释系数必须 体现到 计算结果 中。 样本采集和储存 提取程序需要的粪便样本量为 50-100mg 将粪便样本放入试管中，在 2-8 度可储存 6 天 粪便样本冷冻后，钙卫蛋白的浓度会略有上
9、升。因此，如需长期保持，建议将提取物储存于 -20 度，可保存至少 4 个月。 重要提示 ：样本收集装置不可含有其它生物或化学成分。 试验过程 提取 标准提取程序 1、 将接种环和 贴上标签的空 PE 管称重 2、 用接种环将 50-100mg 的粪便样本加入到 PE 管内 3、 估算样本的净重 4、 向管中 加入提取缓冲液（样本净重的 49 倍） ，并盖紧管子。 粪便重量（ mg） 提取液体积（ ml） 50 2.5 55 2.7 60 2.9 65 3.2 70 3.4 75 3.7 80 3.9 85 4.2 90 4.4 95 4.7 100 4.9 5、 将样本管放入多孔漩涡混匀器，
10、用最高速充分震荡 30分钟，使样本变成匀浆。 6、 将匀浆转移到 2ml 的微量离心管，放入微型离心机，用3000xg 离心 5 分钟。 7、 将上清转移到干净的，贴有标签的管内，可直接用于后续的 ELISA 试验或放入 -20 度或以下储存 4 个月以上。 使用粪便提取装置进行提取 粪便提取装置的操作请参见各装置的说明书。 1、 罗氏粪便提取装置（产品代码 10745804 322）或B HLMANN Smart-Prep (产品代码 : B-CAL-RD)：提取时间（漩涡时间）可缩短到 1 分钟。 2、 ScheBoQuick-PrepTM（产品代码： B-CAL-SO50）：提取管已预装
11、提取缓冲液，提取时间（漩涡时间）约 10分钟。 提取后，用 3000xg 离心 5 分钟，或先将匀浆转移 2mlPE管后再用 3000xg 离心 5 分钟。 将上清转移到干净的，贴有标签的管内，可直接用于后续的 ELISA 试验或放入 -20 度或以下储存 4 个月以上。 ELISA 过程 根据样本中钙卫蛋白的预期浓度，试验可选择两种不同的程序： 低浓度范围程序 和 扩充范围程序 。 样本浓度不超过 600ug/g，选择低范围浓度程序，将样本 1:50 倍稀释，工作范围 10-600ug/g；如果样本浓度超过 600ug/g，选择扩充范围浓度程序，将样本 1:150 倍稀释，工作范围 30-1
12、800ug/g。 低范围 ELISA 程序 工作范围 10-600ug/g 使用前将试剂平衡到 18-28 度 1、 将粪便提取物用孵育缓冲液 1： 50 倍 稀释（例如 20ul提取物加 980ul 孵育缓冲液）并混匀，并保证在 18-28度平衡至少 5 分钟再进行步骤 4C 的操作。 2、 根据标准品、校准品和样本的数目取出足够的板条，将剩余板条立即放入铝箔袋中并密封后放入冰箱冷藏。 3、 用洗涤液洗涤包被孔 两 次 ，每次 每孔 300ul， 甩干 并 在在 吸水纸 上轻轻 拍干。 重要提示 ：必须确保洗涤液每次加入到检测孔后至少孵育 20 秒再进行下一步操作。 4a、第 1 孔加入 1
13、00ul 孵育缓冲液（空白），将标准品 A-E各取 100ul 依次加入到各自孔内。 4b、取低、高值质控品各 100ul 依次加入到各自孔中。 4c、将已 1:50 倍稀释的样本依次加入到后续孔内。 5、 用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转 /分钟的 水平振荡器上 ，于 18-28 度 孵育 30（ +5）分钟 。 6、 移除封板膜，甩干并用洗涤液洗板 三 次 （每孔至少 300ul洗涤液），甩干并在吸水纸上轻轻拍干。 7、 每孔加入 100ul 酶结合物。 8、 用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转 /分钟的水平振荡器上，于 18-28 度孵育 30（ 5）分钟。 9
14、、 移除封板膜，甩干并用洗涤液 洗板 五次 （每孔至少 300ul洗涤液），甩干并在吸水纸上轻轻拍干。 重要提示：确认 TMB 底物已平衡到 18-28 度。 10、 每孔加入 100ulTMB 底物。 11、 用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转 /分钟的水平振荡器上，于 18-28 度 避光 孵育 15（ 2）分钟。 12、 每孔加入 100ul 终止液，用吸嘴移除孔内气泡，并在30 分钟内进行第 13 步操作。 13、 将检测板用酶标仪读数（波长 450nm） 结果 工作范围 10-600ug/g 标准曲线：检测结果包含标准品和空白孔在 450nm 的吸光度（ OD），将标准品
15、的吸光度减去空白的 OD，用半对数坐标纸（ lin/log）绘制吸光度（ Y 轴）和标准品钙卫蛋白浓度（ X 轴），得到最佳拟合曲线和采用四参数拟合方式计算标准曲线。 标本和质控品： 将样本和质控品在 450nm 的吸光度将去空白 OD，再根据标准曲线可求出标本或质控品的浓度。 使用低范围 ELISA 程序时，标准品的 分析 浓度为10,30,100,300,600ug/g。 如果额外稀释，必须将结果乘以稀释因子才能得到最终结果。 性能特点 试剂盒的性能特点根据重复试验确定 工作范围 10-600ug/g 批内精密性： 4.7% 批间精密性 15% 检测极限： 10 ug/g 检出限： 10
16、ug/g 稀释线性： 103% 交叉反应性： 0.1% 扩充范围 ELISA 检测程序 工作范围 30-1800ug/g 使用前将试剂平衡到 18-28 度 通过将样本稀释倍数从 1:50 调整到 1:150，工作范围可扩充3 倍。如果样本的钙卫蛋白预期浓度很高，推荐采用此程序。 1、 将粪便提取物用孵育缓冲液 1： 150 倍 稀释（例如 20ul提取物加 980ul 孵育缓冲液）并混匀，并保证在 18-28度平衡至少 5 分钟再进行步骤 4C 的操作。 2、 根据标准品、校准品和样本的数目取出足够的板条，将剩余板条立即放入铝箔袋中并密封后放入冰箱冷藏。 3、 用洗涤液洗涤包被孔 两 次 ，
17、每次每孔 300ul，甩干并在在吸水纸上轻轻拍干。 重要提示：必须确保洗涤液每次加入到检测孔后至少孵育 20 秒再进行下一步操作。 4a、第 1 孔加入 100ul 孵育缓冲液（空白），将标准品 A-E各取 100ul 依次加入到各自孔内。 4b、取低、高值质控 品各 100ul 依次加入到各自孔中。 4c、将已 1:50 倍稀释的样本依次加入到后续孔内。、 5、用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转 /分钟的水平振荡器上，于 18-28 度孵育 30 （ +5）分钟。 6、 移除封板膜，甩干并用洗涤液洗板 三次 （每孔至少 300ul洗涤液），甩干并在吸水纸上轻轻拍干。 7、 每孔加
18、入 100ul 酶结合物。 8、 用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转 /分钟的水平振荡器上，于 18-28 度孵育 30（ 5）分钟。 9、 移除封板膜，甩干并用洗涤液洗板 五次 （每孔至少 300ul洗涤液），甩干并在吸水纸上轻轻拍干 。 重要提示：确认 TMB 底物已平衡到 18-28 度。 10、 每孔加入 100ulTMB 底物。 11、 用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转 /分钟的水平振荡器上，于 18-28 度 避光 孵育 15（ 2）分钟。 12、 每孔加入 100ul 终止液，用吸嘴移除孔内气泡，并在30 分钟内进行第 13 步操作。 13、 将检测板用
19、酶标仪读数（波长 450nm） 结果 工作范围 30-1800ug/g 标准曲线：检测结果包含标准品和空白孔在 450nm 的吸光度（ OD），将标准品的吸光度减去空白的 OD，用半对数坐标纸（ lin/log）绘制吸光度（ Y 轴）和 标准品钙卫蛋白浓度（ X 轴），得到最佳拟合曲线和采用四参数拟合方式计算标准曲线。 标本和质控品：将样本和质控品在 450nm 的吸光度将去空白 OD，再根据标准曲线可求出标本或质控品的浓度。 使用 扩充 范围 ELISA 程序时，标准品的分析浓度为30,90,300,900,1800ug/g。 如果额外稀释，必须将结果乘以稀释因子才能得到最终结果。 性能特点
20、 试剂盒的性能特点根据重复试验确定 工作范围 10-600ug/g 批内精密性： 4.0% 批间精密性 15% 检出限： 30 ug/g 稀释线性： 102% 预期值 正常值： 小于 50 ug/g 可疑： 50-200 ug/g 阳性： 大于 200ug/g 重要提示 ： 正常值小于 50 ug/g对 4-17岁的儿童（不分性别）同样适用。 附 录 预包被的微孔板 洗板 2 次 加 100ul 标准品、质控品或已稀释样本 水平震荡仪、 18-28 度 孵育 30（ +5）分钟 洗板 3 次 加 100ul 酶结合物 ELISA 检测程序 水平震荡仪、 18-28 度 孵育 30（ 5）分钟 洗板 5 次 加 100ul TMB 底物 水平震荡仪、 18-28 度 孵育 15（ 2）分钟 加 100ul 终止液 450nm 读数（ 30 分钟内）
