1、重组人干扰素 2b 软膏(假单胞菌)Chongzu Ren Ganraosu 2b Ruangao (Jiadanbaojun)Recombinant Human Interferon2b Orintments (P. putida)本品系由高效表达人干扰素2b 基因的腐生型假单胞菌，经发酵、分离和高度纯化后，加入软膏基质制成。1. 基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。2.制造2.1 工程菌菌种2.1.1 名称及来源重组人干扰素 2b 工程菌株系由带有人干扰素 2b 基因的重组质粒转化的腐生型假单胞菌菌株(Pseudomonas putida VG-
2、4)。2.1.2 种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。2.1.3 菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。2.1.3.1 划种 LB 琼脂平板应呈典型的腐生型假单胞菌集落形态，无其他杂菌生长。2.1.3.2 染色镜检应呈棒状，可运动，有荚膜，无芽孢。涂片染色应呈典型的革兰阴性。2.1.3.3 对抗生素的抗性应与原始菌种相符。2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免作）应为典型的腐生型假单胞菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。2.1.3.5 生化反应不液化明胶、不水解淀粉和聚 -羟基丁酸酯（附录） ， 不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成
3、荧光色素。应符合腐生型假单胞菌生物学性状。2.1.3.6 干扰素表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。2.1.3.7 表达的干扰素型别应用抗 2b 型干扰素参考血清做中和试验，证明型别无误。2.1.3.8 质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。2.1.3.9 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。2.2 原液2.2.1 种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用。 2.2.2 发酵用培养基采用适宜的不含任何抗生素的培养基。2.2.3 种子液接种及发酵培养在灭菌培养基中接种适量种子液。在适
4、宜的温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH 值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（附录 G） 。2.2.4 发酵液处理用高速离心法收集处理菌体。收集到的菌体可在-20以下保存，应不超过 1 年。2.2.5 初步纯化采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。2.2.6 高度纯化经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到 3.1 项要求，即为干扰素原液。除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。2.2.7 原液检定按 3.1 项进行。2.3 软膏剂制备采用的基质应符合软膏剂基质要求（附录 I G） 。2.3.1 配
5、制按经批准的配方进行配制。2.3.2 软膏制备按经批准的工艺进行。软膏质地应均匀、细腻、涂展性良好，排除气泡。2.4 成品2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。2.4.2 规格 应为经批准的规格。2.4.3 包装应符合”生物制品包装规程” 和附录G 的规定。3. 检定 3.1 原液检定3.1.1 生物学活性依法测定（附录 X C） 。3.1.2 蛋白质含量依法测定（附录 VI B 第二法） 。3.1.3 比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，每 1mg 蛋白质应不低于 1.0108IU。3.1.4 纯度3.1.4.1 电泳法依法测定（附录 IV C） 。用非还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝
6、胶电泳法，分离胶胶浓度为 15%，加样量应不低于 10g (考马斯亮蓝 R250 染色法) 或 5g (银染法) 。经扫描仪扫描，纯度应不低于 95.0。 3.1.4.2 高效液相色谱法依法测定（附录 III B） 。色谱柱以适合分离分子质量为 560kD 蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为 0.1mol/L 磷酸盐-0.1mol/L 氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量应不低于 20g，于波长 280nm 处检测，以干扰素色谱峰计算理论塔板数，应不低于 1000。按面积归一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的 95.0%。3.1.5 分子量依法测定（附录 IV C） 。用还原型 SDS-聚
7、丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为 15%，加样量应不低于 1.0g，分子质量应为 19.2kD1.92kD。3.1.6 外源性 DNA 残留量每 1 支应不高于 10ng 每 1g 蛋白质应不高于 2ng（附录 IX B） 。3.1.7 宿主菌蛋白残留量应不高于总蛋白质的 0.02%（附录 IX D） 。3.1.8 残余抗生素活性依法测定（附录 IX A） ，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。3.1.9 等电点主区带应为 5.76.7, 供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致（附录 IV D） 。3.1.10 紫外光谱扫描用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约 100g/ml500g/ml，
8、在光路 1cm、波长230nm360nm 下进行扫描，最大吸收峰波长应为 2783nm（附录 II A） 。3.1.11 肽图（至少每半年测定一次）依法测定（附录 VIII E） ，应与对照品图形一致。3.1.12 N-末端氨基酸序列（至少每年测定一次）用氨基酸序列分析仪测定，N-末端序列应为：Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。3.2 成品检定除外观、装量检查外，应按经批准的方法预处理供试品后，进行其余各项检定。3.2.1 鉴别试验按免疫印迹法（附录 VIII A）或免疫斑点法测定（附录 VIII B） ，应为阳性。3.2.2 物理检查3.2.2.1 外观应 为 无 色 半 透 明 膏 体 。3.2.2.2. 装量依法检查（附录 V F） ，应符合规定。3.2.3 pH 值取本品 10g，加入 20g 的水溶解，搅拌均匀。pH 值应为 5.06.5（附录 V A ）。3.2.4 生物学活性应为标示量的 80%150%（附录 X C） 。除另有规定外，用测定培养基充分溶解供试品后测定。3.2.5 微生物限度检查依法检查（附录 XII G） ，应符合规定。4 保存、运输及有效期于 28避光保存及运输。自生产分装之日起， 按批准的有效期执行。5. 使用说明应符合 “生物制品包装规程”规定和批准的内容。
