1、RNAi的作用机制 RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行： (1) siRNA的形成阶段；(2) RNA诱导的沉默复合物 ( RNA-induced silencing complex， RISC)形成阶段 ；(3) 效应阶段 ；(4) 扩增阶段。 RNAi机制外源 病毒 转座子目标识别内切酶切割目标外切酶降解 RNA RdRP合成 RNA激活的 siRNA复合物双链 siRNA异常 ssRNARdRP合成 RNA二级 siRNA目前 ， RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南芥等生物体内阐明的。生物体由于 RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列 (inverted re
2、peats)转录及外源基因导入等原因，细胞中可出现 dsRNA分子 。当 各种原因产生的 dsRNA在细胞中出现时，细胞中一组特定蛋白复合物可识别 dsRNA，此阶段需要 Rde-1、Rde-4和 dsRNA特异性的核酸内切酶 Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别并引导 dsRNA与 Dicer结合，然后Dicer将 dsRNA解旋，再将其裂解为 2125nt大小的小干扰RNA (small interfering RNA， siRNA)。 (1) siRNA的形成阶段核酸内切酶 核酸外切酶解旋酶Dicer同源搜索活性 siRNAslong dsRNADicer contains
3、 two RNAse III domainsDicer定位于胞浆中，但核内 mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在 RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为 2125nt大小在 3端带有 23个碱基悬端和 5端磷酸化的 siRNA诱导的 RNAi效应最强。 19 nt duplex2 nt 3 overhangssiRNAs have a defined structuresiRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的 dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶 (PKR)的激活而使其被降解 ， 从而大大减
4、少了其对mRNA的 抑制作用。在 RNAi启始过程中发挥酶切作用的 Dicer酶属于RNase 核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及 PAZ模体(motif)，其功能是特异地将 dsRNA降解成 siRNA，因此，Dicer酶被认为是启动 RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么 Dicer酶的降解产物是 21nt23nt的 siRNA呢?最近对 RNase 催化结构域的结构的研究使其真相大白。 Dicer 一 种核酸酶 ,负责将 dsRNA 转化为 siRNA ：它属于 RNase 家族 ,具有两个催化结构域、一个解旋酶 ( helicase
5、) 结构域和一个 PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 结构域 , Dicer 在催化过程中以二聚体的形式出现 , 其催化结构域在 dsRNA 上反平行排列 , 形成四个活性位点 , 但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性 , 这两个位点在相距约 22bp 的距离切断 dsRNA , 各种生物体内Dicer结构略有不同 , 致使 siRNA 长度存在微小差别。DicerModels for Dicer cleavage启始阶段加工酶加工成 21-23核苷酸片段DicerRISCmRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解 siRNA的形成siRNADicerRISC(2)RNA
6、诱导的沉默复合物形成阶段 生成的 siRNA和 RNAi特异性酶，如 AGO-2、 MUT-7、RED-1、 PAZ蛋白和 DNA-RNA螺旋酶结合形成 RISC（ RNA-induced silencing complex），具有序列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与 siRNA同源的靶 mRNA。 RNA诱导的沉默复合物 ( RNA-induced silencing complex， RISC)(3)效应阶段 siRNA引导 RISC与同源性的 mRNA结合，在 ATP及解旋酶 (如 Rde-3、 MUT-6、 MUT-14)的作用下使 siRNA链解离，并使 RISC由
7、250X103大小的前体形式变成约 100X103左右活性形式，同时解旋酶催化同源 mRNA与 siRNA的正义链互换，核酸酶在 mRNA与反义 RNA所形成的双链区的 5 起始端下游 710个核苷酸处切断 mRNA，起到特异地抑制基因表达的效果。 效应阶段mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解解旋酶 核酸外切酶同源性检索活性 核酸内切酶RISC在这些机制中， RISC是一个很灵活的平台，在不同的情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能。RISC复合物的核心负责接受从 Dicer加工来的小 RNA，并用该小 RNA作为识别其同源底物的向导从而介导RNAi的发生。RISC（ RNA-induce
8、d Silencing Complex）解旋酶核酸内切酶Argonaute proteinsiRNAmRNA250KD (inactive) 100KD (active)ATP6/9/2014(4)扩增阶段 该 反应以 siRNA中的一条链为引物，以靶 mRNA为模板，在 RNA依赖的 RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase， RdRP)作用下，扩增靶 mRNA，产生新的二级siRNA，而这些 siRNA又能继续反作用于靶 mRNA。 RdRP不仅能增加 siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链 RNA转变为 dsRNA。 RdRP还是一个重要的 “ 感应器 ”
9、 ，它能识别正常和异常的 RNA。转基因 RNA和病毒 RNA都在 RdRP的识别下启动 RNAi的反应过程。 RNAi扩大效应目前，对这些现象的解释至少有四种机制： Dicer 酶将长 dsRNA分子切成短的 “ 初级 siRNA” ，再由后者降解同源的 mRNA，故 dsRNA的长度决定了放大效应的水平； siRNA在酶作用中，可多次利用，能进一步提供放大的信号； 移行 RNAi (transitive RNAi)中， siRNA可作为靶 mRNA的引物，在 RdRP和 Dicer等的作用下产生 “ 次级 siRNA” ，导致沉默信号的扩增。 “ 异常 RNA”(aberrant RNA)
10、 无需引物，可在 RdRP的作用下生成dsRNA，并由 Dicer酶切生成 siRNA。以上四种机制中，尤其是移行 RNAi的发现为阐明沉默效应的扩增及传递提供了重要线索。 移行 RNAi移行 RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动。即沉默信号沿特定的 mRNA由 3 5 方向移动，这就是 “ 移行 RNAi” 。在移行 RNAi中新生成的 siRNA并非直接来自导入的 dsRNA，而是在细胞中 RdRP的作用下，以初级 siRNA的反义链为引物，以靶 mRNA为模板，生成 dsRNA，随后在Dicer酶及 ATP的作用下产生新的 siRNA，称为次级 siRNA。除 RdRP通过产生次级 siRNA参与 RNAi信号扩增外，其他与RdRP具有同源序列的蛋白类似物也通过相同的方式产生次级 siRNA参与沉默信号的扩增。 此外， RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制： (1) Dicer将长 dsRNA切成初级 siRNA，这一放大水平取决于 dsRNA的长度； (2) siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。
