1、第一节 急性毒性作用,机体一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应,一、急性毒性的概念,急性毒性（acute toxicity）,急性毒性的概念,需要注意,急性接触的次数一次，24h多次 中毒效应出现的时间不仅以接触毒物后毒性症状出现的时间，主要以接触毒物的时间，观察时间：714天 强度一次性大剂量，中毒症状明显，常发生死亡,二、急性毒性试验的目的,求出致死剂量及其他急性毒性参数 观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征 为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据 为毒理学机制研究提供线索
2、,急性毒性的参数 半数致死剂量：LD50,急性毒性的参数 剂量-反应曲线,急性毒性的参数 ED,TD,急性毒性的参数 TD,急性毒性的参数,急性毒作用带：Zac=LD50/Limac,霍恩法（Horn）平均移动内插法（moving average interpolation） 改进寇氏法 Bliss法最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法,LD50的几种计算方法,总体原则,三、急性毒性试验方法的要点,实验动物 染毒途径 染毒剂量 观察周期 观察指标的选择、计算方法和评价,急性毒性反应与人近似易于饲养、操作方便繁殖力较强，数量较大价格较低，易于获得,
3、（一）实验动物的选择和要求,主要原则,实验动物的物种和品系,啮齿类（rodent species）,非啮齿类（nonrodent species）,小鼠：昆明种、NIH、ICR,大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar,犬或猴,根据接触途径选择实验动物,急性经口和吸入毒性试验 大鼠、小鼠,急性经皮毒性试验 成年大鼠、豚鼠、家兔,实验动物的物种和品系,大鼠：180-240g 小鼠：18-25g 家兔：2-2.5kg,实验动物的年龄和体重,刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物 小动物根据体重 同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过平均体重的20%,实验动物的性别,雌雄各半 如雌
4、、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值 特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验,实验动物分组与数量,根据组数和每组数量来决定数量 LD50，一般为4-6组 大、小鼠每组10只，犬类6只 严格遵循随机化的原则,实验动物的预检,给药前检疫观察:大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴23周 适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响 筛检健康状况不符合试验要求的动物,实验动物的给药前禁食处理,经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提供饲料 经口多次染毒可不禁食,（二）受试物及处理,水溶液、混悬液、油溶液
5、 水溶性受试物，蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致 水不溶性受试物，溶于或悬浮于适当的有机溶剂中 受试物一般应临用前新配,适宜容积染毒,毒性较大的受试物给药量较小 毒性较低的受试物常需较大量的染毒 给药容积根据染毒途径和实验动物 经口：20ml/kg(空腹动物)经皮：2ml/kg静脉：1ml/kg(5min以上),受试物及处理,(三) 染毒方法,染毒途径的选择应考虑的因素： 模拟人实际接触的途径和方式 有利于不同化学物之间结果的比较 受试物的性质和用途 受试物毒性评价程序的要求,工业毒物：经呼吸道、皮肤农用化学物：经口、皮肤、呼吸道药品：经口、注射、皮肤食品：经口环境污染物：经口
6、、呼吸道、皮肤,染毒途径,染毒方法,消化道、呼吸道、皮肤、注射,染毒途径影响受试物急性毒性,染毒方法,不同途径的吸收量和吸收速率,吸收速率：静脉注射呼吸道肌肉注射腹腔注射皮下注射消化道皮内注射经皮 同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常符合上述规律,经口（胃肠道）染毒,LD50值来比较不同化学物急性毒性大小,灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，等容量灌胃法 吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入,染毒方法,灌胃法,在急性实验中,多采用灌胃法。此法剂量准确。灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。小鼠
7、的灌胃针长约45cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约68cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向,染毒方法,灌胃法,鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为34cm，大鼠或豚鼠为46cm。常用灌胃量小鼠为0.21ml，大鼠14ml，豚鼠15ml,染毒方法,静式
8、吸入染毒 动式吸入染毒,经呼吸道染毒,气管内注入,染毒方法,吸入染毒,静式吸入染毒,染毒方法,方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物 染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算 优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠 缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性,动式吸入染毒,将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制,染毒方法,动式吸入染毒装置的组成,染毒柜 机械通风系统 配气系统,染毒方法,动式
9、吸入染毒设备,动式吸入染毒方式分类,染毒方法,动式吸入接触（动式染毒）面罩接触（面罩吸入染毒）,动式吸入染毒优缺点,染毒方法,优点：受试物浓度和氧分压比较稳定 缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，操作比较复杂，费时费工,经皮肤染毒,染毒方法,农药、化妆品、工业、环境、外用药物 常用大鼠 染毒方式：,脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积的10%） 染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法,经注射途径染毒,染毒方法,注射药品、机制研究、毒物代谢动力学 分类：,（四） 剂量选择,参考新化学物的理化性质 参考相关资料 先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死剂量范围，然后设
10、计正式实验的剂量和分组 根据试验所选的LD50计算方法确定剂量组数,各组剂量的计算,i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1）,或 i =（lgLD100- lgLD0）/（n-1）,i为组距，n为设计的剂量组数。以最低剂量值（LD0或LD10）的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组,剂量选择,剂量选择,化学物LD50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大 我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡,不必计算LD50,全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出现的中毒表现、剂量效应、时间分布。观察记录的内容：
11、,中毒体征及发生过程死亡情况和时间分布体重病理形态学变化,（五） 毒性作用观察,毒性作用观察,中毒体征及发生过程,详细观察和记录动物出现的中毒体征发生时间体征发展的经过 各个系统的特征 初步确定急性毒性靶器官 不同表现提供毒性机制的信息,续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现,毒性作用观察,死亡情况和时间分布,实验动物的死亡数对LD50值产生明显影响 分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息 ：原形，代谢,体重,毒性作用观察,反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标 应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周1次或2次 对体重指标的变化要仔细观察和分析,体重变化的原因,毒性作用观察,影
12、响食欲或消化系统的功能 影响食物的吸收和利用 影响水的摄取 肾功能急性损伤,毒性作用观察,病理检查,死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变 存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查,（六） 观察时间和周期,染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况 给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天2次或多次观察直至试验周期结束,观察周期一般为14天 LD50(LC50)计算时以观察周期内各组动物的总死亡数为依据 不同化学物质引起动物死亡的时间存在个体差异 速杀型化学毒物仅计算24h的死亡率,观察时间和周期,急性毒性试验求出LD
13、50(LC50)值，通过LD50值进行急性毒性分级(acute toxicity classification)，评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小,四、急性毒性分级和评价,急性毒性分级和评价,急性毒性分级和评价,按照急性毒性分级标准评价毒性大小是相对粗略的分级 报告：LD50、急性毒性级别；中毒体征、出现体征时间、死亡前征兆、死亡时间和剂量组间分布、存活动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的病理变化,举例,文献：曹静祥, 治洪, 余淑懿, 等. 硼硒联合对大鼠的急性毒性和亚慢性毒性研究. 卫生研究, 2002,31(4):297-299. 中国预防医学科学院环境卫生与卫生工程研究所
14、,Introduction,Method and materials,Results,Discussions,1,2,3,4,举 例,前言单独的硒、单独的硼均有抗氟作用，有研究表明硼硒联合作用使氟中毒大鼠的康复效果较好。因此，我们在硼硒抗氟药效实验研究的基础上，为了解硼硒联合毒性作用，为现场人群应用硼硒联合防治氟中毒提供试验依据，我们就硼硒联合对大鼠的急性毒性及亚慢性毒性进行试验研究,举 例,材料与方法 主要试剂：四硼酸钠、亚硒酸钠 急性毒性试验：参照霍恩氏（Horn）法，选用80只成年大鼠，雌、雄各半，平均体重220g，随机分为8组。受试物用蒸馏水溶解，动物禁食16小时，经口灌胃一次染毒，观
15、察两周内动物的死亡数，查表计算LD50,举 例,材料与方法 四硼酸钠与亚硒酸钠联合对大鼠的急性毒性实验：根据亚硒酸钠和四硼酸钠的半数致死量，将受试物按比例混合并用蒸馏水溶解，40只，随机分为4组。应用预测与实测LD50的对比法评价两种毒物之间的联合作用性质,举 例,结果 急性毒性试验：急性硒中毒动物在服药5min后出现急性硒中毒症状，最初表现为呕吐、腹泻，然后呼吸困难，四肢痉挛，直至死亡。急性硼中毒动物在服药60min后出现急性中毒症状，表现为不好动、腹泻、口鼻出血，甚至惊厥死亡,举 例,结果,举 例,结果 联合作用评价结果,举 例,讨论 LD50：四硼酸钠对雌、雄性大鼠1470mg/kg。亚硒酸钠对雄性大鼠14.70mg/kg，对雌性大鼠6.81mg/kg。联合对大鼠的急性毒性，雄性大鼠为1727.10mg/kg，雌性大鼠1717.94mg/kg,举 例,讨论 我国工业毒物急性毒性分级标准评价：本实验四硼酸钠与亚硒酸钠混合毒物属于低毒类物质。该毒物的值可为亚慢性毒性实验提供染毒剂量水平的设计依据,举 例,Thank You !,
