1、课题2 月季的花药培养,一、课题背景,植物花药离体培养的意义,缩短了育种周期，为新品种的培育开辟了新途径。,花的结构,二、 基础知识,（一）被子植物的花粉发育,花粉：,花丝,花药,雄蕊,囊状结构，内有很多花粉粒,雄蕊,花粉囊,当花粉囊的壁组织逐步发育分化时，会形成大量的花粉母细胞（小孢子母细胞）。,花粉,花粉粒是由花粉母细胞经过减数分裂而形成，因此，花粉粒是单倍体的生殖细胞。,被子植物花粉的发育要经历：,四分体时期、单核期和双核期等阶段。,基础知识 一、被子植物的花粉发育,阅读课本P37P38,花粉发育过程,减数分裂,有丝分裂,小孢子母细胞花粉母细胞,小孢子,减数分裂,有丝分裂,花粉管细胞核,
2、生殖细胞核,有分丝裂,精子,1个,营养细胞,生殖细胞,4个,4个,4个,4个,4个,8个,（小孢子四分体时期,单核居中期,单核靠边期,双核期）,注意： 二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成） 三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。 两个精子和一个营养核的基因型相同。,卵细胞的形成,大孢子母细胞,减数分裂,4个大孢子（3个退化消失）,3次核分裂,1个卵细胞 5个其它细胞 2个极核,成熟胚囊的结构与功能,极核2:与一精子结合,发育成胚乳,卵细胞1:雌配子,受精后发育成胚.
3、,雄蕊（花药）（花粉粒） 花 柱头花柱雌蕊 （精子2个）卵细胞（1个）1个精子 受精卵 胚胚珠 极核（2个）1个精子 受精极核 胚乳 种子子房 珠被 种皮 果实子房壁 果皮 根、茎、叶,精子2个（生殖细胞核）,花粉管细胞核（营养细胞核）,练习： 写出花粉的发育过程的发育过程（学生板书）假如一种生物体细胞有条染色那么它的小孢子母细胞、小孢子、花粉管细胞核、生殖细胞核各有多少条染色体？如果小孢子母细胞的基因型为AB（两对基因位于两对同源染色体上）那么小孢子、花粉管细胞核和生殖细胞核的基因型是什么？,答案：小孢子母细胞个小孢子单核居中期单核靠边期花粉粒,答案：、，AB或A或B或。无论哪一种，来源于同
4、一个小孢子的花粉管和生殖核的基因一定相同,胚状体,愈伤组织,丛芽,说明：两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。,（二）产生花粉植株的两种途径,人工种子,包上人工种皮,离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段。 第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。 第二阶段是“生长中心”形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。 第三阶段是器官原基及器官形成。 在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种
5、情况： 一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养； 另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。,（三）影响花药培养的因素,1、材料的选择：,不同种类植物的诱导成功率不同。 同一种植物，亲本植株的生理状况对诱导成功率有直接影响。 合适的花粉发育时期：花期早期时的花药比后期更容易产生花粉植株。一般月季的花药培养选择五月初到五月中旬，即月季的初花期。,选择最合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素 原因：不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，在花粉发育的过程中只有一个时期
6、对离体刺激敏感。一般来说细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。,不选择单核期之前花药原因：花药质地幼嫩，容易破碎； 不选择单核期之后花药原因：花瓣开始松动，给材料消毒带来困难； 挑选单核期花药方法：应当选择完全未开放的花蕾，菌少，易消毒。,2、培养基的组成花药培养所采用的培养基各成分中植物生长调节剂的水平和配比起决定作用。 诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基：广泛使用2，4-D、IAA和KT； 诱导分化的培养基常除去2，4-D而以IBA或BA等代之。,3、其他因素： 材料的低温预处理（延缓小孢子衰老）、接种密度、培养的环境条件等对诱导的成功率都有一定的影响。,三、实验操作,（一）材
7、料的选取 （二）材料的消毒 （三）接种和培养,1. 选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。,2. 最常用的方法：,某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。,三、 实验操作,（一） 材料的选取,醋酸洋红法、焙花青铬矾法。,鉴定花粉： 最常用的方法是醋酸洋红法： 花药（载玻片上）1%的醋酸洋红1滴用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成红色） 某些植物的花粉细胞核不易着色，需要采用焙花青铬钒法： 花药（在卡诺氏固定液中处理20min）取出，置于载玻片上焙花青铬钒溶液染色盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）,注：花
8、粉细胞核内有染色体，染色体主要由DNA和蛋白质组成，醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期还是单核靠边期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。,1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒 2、无菌水清洗 3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分 4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中24分钟（也可质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液） 5、无菌水冲洗35次用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。,（二）材料的消毒,灭菌后花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并
9、立即将花药接种到培养基上。,在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。,（三）接种和培养,经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。,每瓶接种花药7-10个，温度控制在25左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。,如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。,对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选。
10、因为在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化。,四、 结果分析与评价,1、选材是否恰当,选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。,2、无菌技术是否过关,如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。,3、接种是否成功,如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。,植物组织培养技术与花药培养技术的异同点,植物组织培养与花药离体培养的比较,细胞的全能性,脱分化、再分化,材料、营养、激素、PH、温度、光照,体细胞,花药
11、（花粉）,正常植株,单倍体植株,花药离体培养与花粉离体培养的异同,一、从概念来看，花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体，且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。 二、从培养层次来看，花药离体培养属器官培养，花粉离体培养属细胞培养，但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成
12、单倍体植株。 三、从培养过程来看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功。,实例一,关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是（ ） A、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的 B、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果 C、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核期、双核期等阶段 D、花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移到细胞中央,注：花粉母细胞经减数分裂形成4个单核花粉粒，每个花粉粒的细胞核进行一次有丝分裂形成1个花粉管细胞核和1个
13、生殖细胞核，每个生殖细胞核再进行一次有丝分裂生成2个精子。,BD,课后习题：,1、F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为Aasusu或Aasusu。如果运用常规育种方法，将F2代中的紫色甜玉米与白色甜玉米（aasusu）进行测交，可以选择出基因型为AAsusu纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时较长，需要至少三年的选种和育种时间。如果利用花药离体培养的技术，在F1代产生的花粉中就可能有Asu的配子组合，再将花粉植株进行秋水仙素处理，使染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体（AAsusu）。这种方法可以大大缩短育种周期。,2、植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌
14、技术及接种操作等基本相同。两者不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾，花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基，对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。,比较杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种,人工种子人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。目前研制的人工种子，是由胚状体、作为保护性外壳的人工种皮和提供发育所需营养的人工胚乳三部分组成的。,能在一定的条件下萌发生长，形成完整植株。,人工种子的优点:首先，它解决了有些作物品种繁殖能
15、力差、结子困难或发芽率低等问题。 第二，人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。 第三，人工胚乳中除含有胚状体发育所需的营养物质外，还可以添加各种附加成分，如固氮细菌、防病虫农药、除草剂和植物激素类似物等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。 第四，用人工种子播种可以节约粮食。例如，一个12 L的发酵罐在20 d内生产的胡萝卜胚状体，可以制成1 000万粒人工种子，满足几千公顷农田的种植需要，与天然种子相比，大大节约了粮食。,练习：小麦高杆（D）对矮杆（d）为显性，抗锈病（T）对不抗锈病（t）为显性，现有高杆抗锈病和矮杆不抗病的两种纯合体，要获得矮杆抗锈病的良种，可用杂交育种和单倍体育种法，步骤如下：,高杆抗锈病 矮秆不抗锈病 P DDTT ddtt (一) F1的基因型表现型 a 各种配子的种类 a（二） 符合要求的单倍体的基因型 良种的基因型表现型 （三） （1）请在上图横线上填写上基因型、表现型内容。 （2）图中（一）（二）（三）采用的处理方法分别是 、 、 。 （3）单倍体育种方法的主要优点是 。,答案：（1）DdTt，高秆抗锈病，DT，Dt,dT, dt, ddTT矮秆锈病（2）杂交育种、花药离体培养，秋水仙素处理（3）可以明显缩短育种年限，加速育种进程。,
