1、骨髓间充质干细胞输注对重型再生障碍性贫血治疗【摘要】 本研究探讨人源骨髓间充质干细胞（MSC）输注对免疫介导性再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能及生存率的影响.采用雌性 BALB/c 小鼠 30 只，参照姚 军等方法建立免疫介导性再生障碍性贫血模型，实验分模型组、MSC 组及照射 组。 MSC 组于制模后3 天从小鼠尾静脉 1 次性输注人骨髓 MSC 1106，观察各组小鼠外周血象变化、第 28 天存活率、骨髓有核细胞数量、造血集落生成和骨髓病理学特征。结果显示：于制模后第 7 天，模型组外周血 WBC 显著低于 MSC 组和照射组 ，分别为（0.650.05）109/L， （2.450.71
2、）109/L，（2.300.33）109/L；第 10 天 3 组均表现为 全血细胞减少，第 14 天模型组血象指标仍持续降低，而 MSC 组及照射 组血象指标开始回升，至 28 天 3 组小鼠存活率分别为 18.2%、80%和 100%，MSC 组小鼠存活率显著高于模型组（p0.01）。MSC 组小鼠单侧 股骨有核细胞数量、造血祖细胞集落生成数量均显著高于模型组，而与照射组结果一致。结论：MSC 输注可减轻 再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血衰竭程度，提高存活率。Effect of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Infusion on Hemato poie
3、sis in Mice with Aplastic AnemiaAbstract To explore the effects of infusion with human mesenchymal stem cells from bone marrow on bone marrow hematopoietic function and survival in mice with aplastic anemia (AA), immuno mediated aplastic anemia mice model was established according to Yaos method. Th
4、irty BALB/c female mice were divided into AA model group, MSC group and radiation group. In MSC group, 1106 MSC was infused by intravenous injection at 3 days after establishment of model. Thechanges of blood count， the number of nuclear cells in a single thigh bone, colony forming units(CFU), patho
5、logical features of bone marrow and survival rate of mice were observed in all groups. The results showed that the number of white blood cells in peripheral blood of AA model group at day 7 after establishment of model was （0.650.05）109/L , whichwas significantly lower than those in MSC group and ra
6、diation alone group, respectively. Pancytopenia was found in all three groups at day 10. At day 14 the pancytopenia was continued in AA model group while it was less severe in MSC and radiation groups. In MSC group the number of nucleated cells in single thigh bone and pathological slice as well as
7、CFU GM were significantly higher than those in AA model group, respectively. The survival rate of mice in MSC group was 80.0% which was higher than that of group in AA model (18.2%, p0.01).There were no significant differences between MSC group and radiation alone group in bone marrow hematopoiesis
8、and survival rate. It is concluded that MSC infusion reduces the degree of bone marrow failure and improve survival of immuno mediated AA mice model.KEY WORDS APLASTIC ANEMIA； ANIMAL MODEL； MESENCHYMAL STEM CELL； HEMATOPOIESIS骨髓间充质干细胞（MESENCHYMAL STEM CELLS, MSC）除具有促进造血干细胞移植后造血重建外，还具有免疫调节作用，防治移植物抗宿主
9、病1，2。获得性再生障碍性贫血主要是 T 淋巴细胞介导的骨髓造血功能衰竭3，4，且再生障碍性贫血患儿骨髓 MSC 体外增殖能力较正常对照儿童明显减弱文献6建立免疫介导性再生障碍性贫血模型。取 DBA/2 小鼠颈椎脱臼处死，常规消毒，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、 肠系膜等处淋巴结，分别获胸腺、淋巴结细胞悬液,细胞浓度为 5106/ML，按胸腺细胞与淋巴结细胞以12 比例混合，即胸腺淋巴结细胞悬液。台盼 蓝鉴定细胞活性，活性 细胞 95%。雌性 BALB/C 小鼠经 5 GY 60CO 射线全身照射（剂量率125.35 CGY/MIN），照射后 20 小时内由尾静脉注 入 DBA/2
10、小鼠胸腺淋巴结细胞 1106/只。小鼠照射后立即移入中山大学动物实验中心 SPF 级无菌层流室内，饮用加有庆大霉素（40 万 U/L）和二性霉素B（50 MG/L）高压灭菌水，每日观察并记录小鼠体重、活动力、外表、饮食、大便、死亡情况，制模后 28 天实验终止。MSC 分离、扩增及输注取正常儿童骨髓 2 ML，按本室已建立的方法7进行 MSC 分离、扩增，传代至 4-5 代时收获细胞，于制模后第 3 天（照射后 72 小时）经小鼠尾静脉注射人源 MSC 1106。实验分组雌性 BALB/C 小鼠 30 只，分为 3 组：再生障碍性贫血模型组：11 只，照射+ 胸腺淋巴结细胞输注； MSC 组：
11、10 只，照射+胸腺淋巴结细胞输注+MSC 输注；单纯照射组： 9 只，仅照射。观察指标生存率及生存曲线。 比较各组小鼠生存情况。外周血象检测 于制模后第 7、10、14、21 天分别断尾，微量吸管采集肝素抗凝血 20 L，细胞计数仪检测白细胞（WBC）、血红蛋白（HB）、血小板（ PLT）水平。单侧股骨有核细胞数测定及骨髓造血祖细胞集落培养 于制模后 28 天或濒死时颈椎脱臼处死实验小鼠，在无菌条件下取出右侧股骨，用不含血清 IMDM 培养液冲洗细胞，离心，弃上清，加 1 ML IMDM 混匀，计单测股骨有核细胞数量。取 2104 细胞接种于 1 ML甲基纤维素半固体培养基 METHOCUL
12、TTM GFM3434（美国 STEM CELL 公司产品）中进行造血祖细胞集落培养，于第 7 天在倒置显微镜下计数粒 巨噬细胞集落（CFU GM ）。组织学检查 于制模后 28 天或濒死时颈椎脱臼处死实验小鼠，取小鼠肝、脾及左侧股骨，富尔马林固定，石蜡包埋切片，HE 染色,显微镜下观察组织学变化。统计学处理用 SPSS 11.5 软件处理资料，多组均数的比较采用ONE WAY ANOVA, 绘制 KAPLAN MEIER 生成函数曲线并对其进行 LOG RANK 检验 。结 果MSC 对再生障碍性 贫血小鼠存活率的影响照射组于照射后 2-3 天、2 周体重轻微下降，3 周左右恢复正常，至 2
13、8 天时均存活。模型组于制模后 3-7 天体重明 显下降，第 9 天略有回升，12 天再次明显下降，苍白、活 动明显减少，弓背，松毛，9 只于12-19 天死亡，解剖发现各脏器苍白，胸腺、脾脏、淋巴结萎缩，部分小鼠小肠有出血点，另 2 只于 3 周后体重回升，活动渐增多，毛光滑，模型组小鼠 28 天存活率为 18.2%。MSC 组体重变化与照射组相似，2 只于 16 天死亡，其 28 天存活率为 80%。各组 KAPLAN MEIER 生存函数曲线如图 1 所示，MSC 组与模型组生存曲 线比较差别具有极显著意义（LOG RANK 统计量=7.33 ，P=0.0068）。MSC 对外周血象的影响结果见附表。如表所示，模型组小鼠于制模后 7 天 WBC 明显下降，与 MSC 组及照射组比较差异均具有显著意 义（P0.01）；10 天时 3组血象指标均显著降低；14 天时模型组外周血象仍明显降低，而MSC 组和照射组开始回升，至 21 天血象基本恢复正常。 9 只再生障碍性贫血模型鼠于 3 周内死亡，2 只生存至 21 天时血象亦逐渐回升。
