1、蛋白质分选与膜泡运输Protein Sorting and Vesicular Transport,第八章,2018/3/8,2,教学安排,计划学时：2学时 主要内容： 蛋白分选 信号肽学说 蛋白分选的基本途径与类型 跨膜转运 膜泡运输 膜泡的装配与运输 膜泡的锚定与融合 讲授重点：信号肽学说,2018/3/8,3,蛋白质的分选（protein sorting）：又称蛋白质的定向转运（protein targeting），指绝大多数的蛋白质均在细胞质基质中的核糖体上开始合成，然后转运到细胞的特定部位，装配成结构与功能的复合体，才能参与细胞的生命活动这一过程。,2018/3/8,4,1 细胞内蛋
2、白质的分选,细胞内合成的蛋白质、脂类等物质之所以能够定向的转运到特定的细胞器取决于两个方面： 蛋白质中包含特殊的信号序列（signal sequence） 细胞器上具特定的信号识别装置（分选受体，sorting receptor）,2018/3/8,5,一、信号肽(Signal peptide),George Palade 发现游离核糖体合成非分泌蛋白，RER核糖体合成分泌蛋白 1975，Blobel and Sabatini 提出信号肽学说 体外翻译-转运系统获得相关证据 1999，Blobel获得诺贝尔生理医学奖,2018/3/8,6,信号序列（signal sequence） N-端16
3、-26个氨基酸残基 无特异性 信号斑（signal patch） 存在于完成折叠的蛋白质中 构成信号斑的信号序列之间可以不相邻,一、信号肽(Signal peptide),2018/3/8,7,signal sequence and signal patch,2018/3/8,8,一、信号肽(Signal peptide),信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP） 位于细胞质基质 是核糖核蛋白复合体 与信号肽及核糖体结合 信号识别颗粒受体/停泊蛋白（Docking protein, DP） 存在于完成折叠的蛋白质中 构成信号斑的信号序列之间可以不相邻,1
4、975年Blobel和sabatini等提出了信号假说（signal hypothesis），即分泌性蛋白N端作为序列信号肽（signal sequence或signal peptide），指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，在蛋白合成结束前信号肽被切除。信号识别颗粒(SRP)和内质网膜上的信号识别颗粒的受体（停泊蛋白,DP）等因子协助完成这一过程。,信号假说,一些典型的分选信号,信号序列（signal sequence）：存在于蛋白质一级结构上的线性序列，通常由15-60个氨基酸残基组成，有些信号序列在完成蛋白质的定向转移后被信号肽酶（ signal peptidase）切除；通常信号序列对所引
5、导的蛋白质没有特异性要求。信号斑（signal patch）：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。每一种信号序列决定特殊的蛋白质转运方向。,分泌性蛋白N端序列为信号肽，指导分泌蛋白到内质网上合成，在蛋白合成结束之前信号肽被切除。信号识别颗粒和内质网膜上的信号识别颗粒的受体（停泊蛋白）等因子协助完成这一过程。,信号识别颗粒的受体,信号识别颗粒,2018/3/8,13,二、蛋白分选转运的基本途径与类型,核基因编码蛋白分选基本途径： 后翻译转运途径(post-translational translocation) 在游离核糖体上合成 靶区：
6、线粒体、过氧化物酶体、细胞核、细胞基质或骨架 共翻译转运系统(co-translational translocation) 在游离核糖上起始合成 SRP引导转运到RER 边合成，边转运 靶区：细胞质膜及细胞内膜系统,（二）信号肽与共翻译, 肽链边合成边转移至内质网腔中的方式称为共转移。 跨膜蛋白的起始转移序列和终止转移序列 起始转移序列：蛋白质氨基末端的信号序列除作为信号被SRP识别外，还具有起始穿膜转移的作用。 停止转移序列：肽链中还有某些序列与内质网膜具有很强的亲合力而结合在脂双层之中，能阻止肽链继续进入内质网腔，使其成为跨膜蛋白质，称为停止转移序列。 内部信号序列： 跨膜蛋白的类型及其
7、取向起始转移序列和终止转移序列的数目决定多肽跨膜次数,2018/3/8,15,2018/3/8,16,二、蛋白分选转运的基本途径与类型,蛋白分选的转运方式或机制分4类： 跨膜转运（transmembrane transport） 膜泡运输（vesicular transport） 门控运输（gated transport）：通过核孔复合体运输 基质中的蛋白转运,2018/3/8,17,三、跨膜转运（transmembrane transport）,跨内质网膜转运 跨线粒体膜转运 跨过氧化物酶体膜转运,2018/3/8,18,膜泡运输是蛋白分选的一种特有方式膜泡运输还形成了细胞内膜脂流动(mem
8、brane flow)转运膜泡出芽发生在特定区域：蛋白信号与受体结合部位转运泡在细胞内沿微管或微丝运输：膜泡运输有关的马达蛋白有3类动力蛋白（dynein）：趋向微管负端驱动蛋白（kinesin）：趋向微管正端肌球蛋白（myosin）：趋向微丝的正极,2 细胞内膜泡运输,2018/3/8,19,2018/3/8,20,一、衣/包被类型,已知三类：笼形/网格蛋白(clathrin)COPI(coat protein I)COPII(coat protein II)主要作用：选择性的将特定蛋白聚集在一起，形成运输小泡如同模具一样决定运输小泡的外部特征,2018/3/8,21,三种包被小泡的功能,2
9、018/3/8,22,（一）网格/笼形蛋白衣被小泡,运输途径：质膜内体；高尔基体内体；高尔基体溶酶体、植物液泡。网格结构：3重链、3轻链，形如triskelion，clathrin 的曲臂交织在一起，形成5边形网孔的笼子衔接蛋白：连接包被与受体。,2018/3/8,23,Clathrin coated vesicles,2018/3/8,24,Selective transport by clathrin coated vesicles,2018/3/8,25,当衣被小泡形成时，可溶性蛋白dynamin聚集成一圈围绕在芽的柄部，使柄部的膜尽可能地拉近（小于1.5nm），导致膜融合，pinch
10、off衣被小泡。,2018/3/8,26,（二）COP I衣被小泡,功能：回收、转运内质网逃逸蛋白（escaped proteins）返回内质网；也可介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。 组成：由7种蛋白组成。回收信号：Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。,2018/3/8,27,COP I Vesicles,2018/3/8,28,Cop I and II Vesicles,2018/3/8,29,Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）,2018/3/8,30,（三）COP衣被小泡,介导内质网到高尔基体的物质运输。形成于内质网出口位点，该处无核糖体。主要亚基：Sar1GTP、Se
11、c23/Sec24、Sec13/Sec31。多数跨膜蛋白直接与COP II结合，少数跨膜蛋白和多数可溶性蛋白通过受体与COP II结合。分选信号：位于跨膜蛋白胞质面，形式多样，常包含双酸性基序DEXDE ，如Asp-X-Glu。,2018/3/8,31,COP II Vesicles,2018/3/8,32,COPII Coated vesicle,2018/3/8,33,二、衣被形成,衣被召集GTP酶：为G蛋白，活化状态可引起衣被蛋白聚集，包括ARF和SAR 1。存在于细胞质，激活后转位到膜上。ARF：参与clathrin和COP I衣被的形成。SAR 1：参与COP II衣被的形成。,20
12、18/3/8,34,ER上形成COPII小泡时，SAR1交换GDP/GTP而激活。激活的SAR1暴露出脂肪酸链尾巴，插入ER膜，促进衣被蛋白的核化和组装。SAR1可激活磷脂酶D，将一些磷脂水解，使衣被蛋白牢固地结合在膜上。当小泡从膜上释放后，衣被很快就解体。,2018/3/8,35,Coat assembly,2018/3/8,36,三、膜泡运输的定向机制,（一）SNAREs 功能：介导运输小泡与靶膜的融合。类型：v-SNAREs和t-SNAREs。结构：具有一个螺旋结构域，相互缠绕形成跨SNAREs复合体，将小泡与靶膜拉在一起。,2018/3/8,37,SNAREs,2018/3/8,38,
13、SNAREs in vesicle transport,2018/3/8,39,神经细胞中，SNAREs负责突触小泡的停泊和融合。破伤风毒素和肉毒素能选择性地降解SNAREs，阻断神经传导。病毒融合蛋白的工作原理与SNAREs相似，介导病毒与宿主质膜的融合。,2018/3/8,40,HIV fusion protein,2018/3/8,41,（二）Rabs,也叫targeting GTPase，属于G蛋白，起分子开关作用。已知30余种，不同膜上具有不同的Rabs。Rabs促进和调节运输小泡的停泊和融合。Rabs还有许多效应因子，帮助运输小泡聚集和靠近靶膜，触发SNAREs抑制因子。,2018
14、/3/8,42,Rabs in docking,2018/3/8,43,复习思考题,1. 名词解释： 信号肽；共翻译转运；后翻译转运2. 什么是分泌性蛋白合成的信号肽学说？涉及哪些组分？各组分间是如何协同的？3. 蛋白分选转运的方式有哪几类？4. 转运膜泡在细胞内运输的轨道有哪些？与之相关的马达蛋白有哪些？5. 包被蛋白主要有哪几种？其主要作用是什么？ 6. 三种包被小泡各自介导哪些运输方向？7. SNAREs 主要功能是什么？主要有哪几种类型？,2018/3/8,44,在游离核糖体上起始合成 SRP结合信号肽后暂停翻译 SRP与RER上的DP结合 信号肽与移位子结合，打开孔道 SRP脱离，肽
15、链合成重启 信号肽被切除、降解 肽链合成终止，核糖体释放，肽链折叠,（一）蛋白向RER跨膜转运,2018/3/8,45,开始转移序列(start transfer sequence)停止转移锚定序列(internal stop-transfer anchor sequence,STA)内在信号锚定序列(internal signal-anchor sequence, SA),ER膜整合蛋白的拓扑学类型,2018/3/8,46,（二）线粒体蛋白质的跨膜运送,核基因编码的线粒体蛋白的合成和输入大体上要涉及到4个步骤：,在细胞质溶质中合成多肽前体物 前体物和细胞器表面的受体结合 穿过并移进细胞器膜
16、前体物被加工成成熟多肽,2018/3/8,47,含有较为丰富的带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸)，穿插在不带电荷的氨基酸序列之间，对牵引蛋白质跨膜具有重要作用基本不含带负电荷的酸性氨基酸序列中羟基氨基酸(尤其是丝氨酸)的含量较高整个前导序列可形成既具亲水性又具疏水性的两性-螺旋凭藉外正内负的膜电位，使前导肽及其所牵引的蛋白质得以顺利过膜,线粒体前导序列的特点：,2018/3/8,48,线粒体蛋白质特有的导肽序列(a) 导肽的线性序列；(b) 导肽的折叠后的氨基酸残基的分布图,2018/3/8,49,输入蛋白在输入之前，首先要与伴侣蛋白Hsc70结合，而去折叠。线粒体外膜中有输入受体蛋白(如T
17、OM20和TOM22)，可识别基质定位序列，并与之结合，将前体蛋白送入外膜通道(由TOM40构成)。,线粒体基质蛋白的输入,定位于基质中的蛋白质还要再通过内膜通道(由TIM23和TIM17)进入基质，在此部位外膜和内膜紧贴在一起。,translocon of the outer membrane, TOM,translocon of the inner membrane, TIM,import receptor,定位序列在基质中被蛋白酶切除。在内膜转移通道处有基质Hsc70陪伴蛋白，该蛋白与TIM44接触水解ATP，驱动基质前体蛋白转运到基质中。多肽链在伴侣蛋白作用下折叠和装配成三维和四维结构
18、。,TOM20/22,线粒体内、外膜接触部位电镜图,2018/3/8,50,靶向线粒体基质的跨膜运送,2018/3/8,51,靶向线粒体膜间隙的跨膜运送,途径A是主要的注意与内膜蛋白途径A不同点,2018/3/8,52,一次性穿膜蛋白二次穿膜蛋白 多次穿膜蛋白,线粒体内膜蛋白的输入,一次性穿膜蛋白 如细胞色素氧化酶的CoxVa亚基，其前体蛋白的N末端含有基质定位序列，此序列可被TOM20/22输入受体识别，通过外膜的通用输入孔和内膜的TIM23/17转移复合物输入到基质中。输入过程中，基质定位序列被切除。CoxVa含有一个疏水性停止转移序列(stop-transfer sequence)，当蛋
19、白质穿过TIM23/17通道时，停止转移序列阻止C-端穿过内膜，然后肽链转移到脂双层中。,二次穿膜蛋白 肽链含有基质定位序列和2段内部疏水区(Oxl 1定位序列)，肽链进入基质后，基质定位区被切除。Oxl 1疏水区被内膜中的Oxa 1蛋白所识别，并将蛋白质插入脂双层中。,多次穿膜蛋白 这类蛋白质N末端没有基质定位序列，而肽链内部含有多个定位序列。如ADP/ATP对向转运体(antiporter)，此蛋白含有6个穿膜区为定位序列，外膜中的TOM70可识别内部定位序列。通过外膜的通用运输孔穿过外膜，在膜间隙中的TIM9/10的协助下，蛋白质被移送到内膜中的转移复合体(由TIM22/54组成)，负责
20、将输入蛋白的疏水性定位序列移入内膜脂双层中。,2018/3/8,53,靶向线粒体内膜的跨膜运送,TOM: translocon of the outer membraneTim: translocon of the inner membrane,2018/3/8,54,外膜蛋白质的输入,停止转移信号 为N-端基质定位序列之后一段疏水性氨基酸片段 可阻止蛋白质进入基质，同时使蛋白质结合到外膜,此途径中，蛋白质输入后，其基质定位序列和内部疏水性序列均不切除。,2018/3/8,55,4、膜间隙蛋白质的输入, 主要途径, 穿外膜直接途径,穿外膜直接途径 输入蛋白质通过外膜的TOM40通用输入孔，直接
21、将蛋白质释放到膜间隙中，不涉及到内膜，与内膜转移因子无关。例如细胞色素c血红素裂合酶(负责血红素与细胞色素c共价结合)，是一种线粒体膜间隙蛋白。,主要途径 前体物肽链中含有两个不同的N末端定位序列。例如细胞色素 b2，进入基质后，N末端第一个序列被基质中的蛋白酶切除。第二个序列阻止肽链完全穿过内膜，前体物变成内膜TIM23/17通道中的中间物。中间物侧向扩散，离开TIM23/17通道。内膜中的蛋白酶切除穿膜的疏水性片段，将成熟的蛋白质以可溶性形式释放到膜间隙中。,2018/3/8,56,线粒体输入蛋白定位序列的排列形式大多数线粒体蛋白含有N末端基质定位序列，但各种蛋白质的不相同。,2018/3
22、/8,57,核基因编码的线粒体蛋白不都是通过前述途径转运的 有的线粒体外膜蛋白无前导序列，不以前体形式运送插入 细胞色素c可能是直接扩散通过外膜而进入线粒体，再在细胞色素c-血红素裂合酶催化下，加上血红素后成为成熟型并定位于内膜外侧。,注意！,2018/3/8,58,(三) 过氧化物酶体中的蛋白质输入,无论是膜上还是腔中的蛋白都是在细胞质基质中合成 绝大多数过氧化物酶体基质蛋白的C-端含有过氧化物酶体定位序列(peroxisomal-targeting sequence, PTS 1) SKL(Ser-Lys-Leu) PST1无特异性：当把这一短的信号序列连接到细胞质中的任何蛋白质上，都可使
23、该蛋白质被输入过氧化物酶体中。,2018/3/8,59,过氧化物酶体基质蛋白由PTS1定位序列引导输入,第1步：过氧化氢酶和其他大多数基质蛋白C末端均含有PTS1摄取定位序列，此序列与细胞质溶质受体Pex5结合。,第2步：结合了基质蛋白的Pex5与过氧化物酶体膜上的Pex14相互作用。,第3步: 基质蛋白-Pex5复合物被转移到一组膜蛋白(Pex10/Pex12/Pex2)上，基质蛋白被输入到过氧化物酶体基质中。,第4步：在基质蛋白转移过程中或在腔内，Pex5与基质蛋白解离，返回细胞质溶质中，返回过程中还要涉及到Pex10/Pex12/Pex2复合物和另外一些膜蛋白及细胞质溶质蛋白质。,输入蛋白质可以折叠状态进入过氧化物酶体，输入后定位序列不切除.,
