1、琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）一、试验原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。 二、试验器材、化学试剂及菌种培养皿、试管、5uL50uL 微量移液器，100uL1000uL 微量移液器以及配套的枪头、10mL 离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS 缓冲液、无菌水、95%乙醇。菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌三、试
2、验步骤1、实验工器具准备及灭菌在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同 PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121杀菌25min。将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170杀菌 2h。实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌 30min 以上。2、倒培养皿将培养基及培养皿放置到 60后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒1520mL 左右，倒好后水平静置至完全凝固。3、菌悬液的制备从冰箱取出需要测试的菌种活化 0.5h 后，加入 5mL 的 PBS 缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打 80 次，使菌株完
3、全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取 1mL 的菌液加入到 4mL 的 PBS 缓冲液中，再吸取 1mL 稀释的菌悬液依次进行 5 倍梯度稀释，选择 108CFU/mL 左右的菌悬液或 106CFU/mL 左右的孢子悬浮液（对比 0.5 麦氏比浊管） ，将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为 106/CFU/mL 左右的菌悬液或 104CFU/mL 左右的孢子悬浮液）进行试验。4、试验菌的接种用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液 0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基） ，盖好
4、培养皿。5、抑菌剂的配置用分析天平准确称量 1g 样品于灭菌后的 15mL 离心管内，加入 10mL 溶剂（无菌纯水、95%乙醇等） ，摇匀使溶解（根据情况可使用电动混合器摇匀或放入水浴锅中加热使溶解） 。溶解后吸取上清液对倍稀释样品，可根据情况决定稀释几次，一般稀释 610 次。若样品是液体，可直接对倍稀释。6、添加抑菌剂6.1 在培养皿上打三个孔，用 10100uL 的枪头打孔，打完孔用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出（打孔时一次打孔，不能转动枪头，以防琼脂圈裂缝，影响药液扩散以致抑菌圈不均匀，每次无菌针头挑完后都要酒精灯烧一下灭菌） 。各孔中心之间相距 25mm 以上，与培养皿的周缘相距
5、15mm 以上。用微量移液器吸取抑菌剂 20uL 到琼脂孔内（三个孔为一组） ，盖好培养皿。6.2 用不加抑菌剂的培养皿、加入配抑菌剂时的溶剂做阳性对照，用未接种菌的培养皿做阴性对照。7、培养培养皿并观察抑菌效果于 37生化培养箱中正置培养，培养 16h18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。注：每个培养皿做一个浓度，测量抑菌圈时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌圈进行。 测量其直径应以抑菌圈外沿为界。4、试验结果各浓度抑菌剂抑菌圈直径（mm）抑菌剂浓度123平均值阳性对照结果： 阴性对照结果： 五、评价规定1、抑菌作用的判断:抑菌圈直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。抑菌圈直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。大于 7mm 小于 10mm 判为钝敏；大于 10mm 小于 20mm 判为中敏；大于 20mm 为高敏。2、3 次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。3、注意事项(1)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌圈常因之增大; 浓度过高，接种量过多，抑菌圈则可减小。(2)应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌圈的大小。(3)培养时间不得超过 18h。培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌圈变小。(4)抑菌圈直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。
