1、1,徐州医学院 病理学教研室,常规组织病理技术,2,病理学是研究疾病发生发展规律的学科，主要的研究范围是疾病发生发展过程中组织、细胞代谢、功能及结构的变化。病理学的发展与科学技术发展息息相关，因为病理学的发展与使用的工具和方法（即技术）的更新密切相关。,3,解剖剪刀,尸体解剖,器官病理学,显微镜,细胞,细胞病理学,电 镜,超微结构,超微病理学,免疫学,免疫组化,免疫病理学,分子生物学,分子病理学,计算机及网络,信息病理学,工具和方法的更新与病理学的发展,4,病 理 学理 论,病 理 学技 术,病 理 学理 论,5,技术是病理学发展之母！,6,病理学,传统病理学 现代病理学 形态学 以形态学为基
2、础 器官病理学 与其他技术相结合细胞病理学 免疫病理学超微病理学 分子病理学,7,8,免疫组化 HE,乳腺导管,9,免疫荧光 HE,10,结肠癌 EB病毒原位分子杂交,11,Fish检测 人类表皮生长因子受体2基因 （human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）,12,常规组织病理技术,内容 formalin固定 石蜡切片制作 HE染色等 基本研究形态学必不可少的重要方法 基础常规组织病理技术是现代新技术基础 优点简单易操作，基本满足日常工作需要（常规技术、常规染色）,13,取材,HE染色,封固,常规技术基本流程,固定,切片,常规技术的完成是制作出
3、染色良好的HE切片,脱水、透明、浸蜡、包埋,14,HE,15,第一节 组织与细胞标本的选择,组织标本的选择即取材，取材的目的是正确的获取所需要的标本或标本的某一部位。,16,一、 组织标本的选择（取材）,从大体标本上按病理检查或研究的目的、要求切取适当大小的组织块，供制片进行显微镜检查。,17,材料要求：新鲜、数量、质量取材包括两个步骤：从人体（活检、手术、尸检）或动物体上获取器官、组织进一步将其切取为制片所需组织块,18,切取组织块必须注意下列几点：1.避免人为损伤组织：2.取材部位总的要求能够反应组织结构特点及病变特点且能够表明病变部位与周围组织的关系。 （1）组织块应包括各脏器的重要结构
4、,19,肾脏取材,20,取材,21,（2） 组织块的采取应在主要病变部位及正常与病变交界处,22,23,（3）肿瘤标本的选择肿瘤本身、边缘、肿瘤连同脏器表面和底、切端，转移灶，尽量避开继发病变,24,乳腺癌,25,胃,26,注意包埋面,27,3. 组织块大小一般不超过21.50.3cm为宜,28,4.取材数量原则: 凡可疑处均要取材,29,5. 编号、标记,30,6.取材剩余组织块可放于70%酒精中保存有利于日后再取材时细胞染色，瓶子内外亦需以标签注明号码。注意：尽量保留一定量的组织 不要随意丢弃标本,31,脱钙骨组织需先脱钙再取材,32,二、细胞取材及制片收集和制片方法1.印片法2.穿刺法3
5、.沉淀法4.活细胞标本的制备,33,第二节 组织的固定,凡是需要制作病理检查标本的各种组织，无论是制作切片标本还是大体标本，首先必须固定。固定的目的是使离体的组织、细胞尽量保持生活状态以利观察、研究。,34,一、概念将各种组织浸入某些化学试剂内，使细胞内的物质能尽量保持其生活状态的形态结构和位置，叫做固定。,35,二 .固定组织的目的 （1）保持细胞与生活时的形态相似（自溶、 腐败）； （2）固定可使组织内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分凝固成不溶性物质，保持其原来结构； （3）增加组织对染料的亲和力 ，易着色； （4）组织硬化，便于取材、切片。,36,由组织固定不当或不良对标本造成的影响是无
6、法纠正和弥补的!,37,38,39,40,三. 固定注意事项 （1）固定的组织越新鲜越好 （2）固定液的量：约1：10固定容器：足够大 , 开口不宜太小 （3）固定的温度：室温(25) （4）特殊类型染色对固定要求严格，组织的大小、固定的时间、温度的适当都应注意。,41,有专家说：若你能取到新鲜的组织，能切到厚24mm的切块和记得固定液是十倍于组织块的总体积，你的诊断的正确性已得到了80的保证。,42,四. 固定剂和固定液 用于固定组织的化学物质称为固定 剂或固定液。,固定剂/单纯固定液由单一化学物质组成,混合固定液/复合固定液由多种化学物质混合组成,43,(一)单纯固定液 1. 甲醛： 优点
7、 固定后的组织很少收缩。能保存脂肪和类脂质（用冰冻切片法），也可固定高尔基体、线粒体，又是糖的保存剂，使肝糖变成微细的颗粒团。穿透力强（4小时穿透深度2.7mm，8小时为4.7mm，12小时为5mm），固定均匀，能增加组织的韧性，便于取材。甲醛固定的标本核染色甚佳。价格低廉。,44,缺点：经甲醛固定的陈旧组织，尤以多血的肝脾组织易发生黑色或棕黑色的沉积（粒状结晶），称甲醛色素。甲醛氧化 - 蚁酸与血红蛋白结合福尔马林色素避免长时间固定， 固定后流水冲洗尿酸结晶可被溶解。,45,甲醛固定液的配制:（1）10% formalin市售甲醛（浓度为3740%） 1份水 9份(2)中性甲醛以PH7.2-
8、7.4PBS为溶液配制的甲醛固定液,46,优点： 如要证明尿酸结晶和保存糖类，则须用100%酒精固定。在已用别种固定液后，可用70%酒精较久的保存组织。 酒精既有固定作用，又有脱水作用。,2.乙醇,47,缺点：经酒精固定的标本对核的染色不良，也不利于 染色体的固定。要证明细胞含的脂肪和类脂质时，不能用酒精固定。如要证明组织内的色素时，不宜以酒精作为固定剂。不适用于固定大块组织。 酒精价格较贵。,48,80%-95%的酒精作为固定剂为好高浓度酒精组织硬化显著,放置过久组织收缩明显且质脆,不但影响制片, 组织形态也不好。很少单独使用,49,（二）复合固定液1.A-F液（酒精-甲醛固定液）有固定兼脱
9、水作用配制方法:95%酒精（A） 90ml40%甲醛（F） 10ml,50,2.Carnoy液固定胞浆和胞核,对染色体固定佳,显示DNA和RNA效果好.也常用于糖原和尼氏体的固定.不能保存脂质有防止酒精的硬化收缩作用,穿透力强,适用于外膜致密的组织配置方法： 无水酒精60ml，冰醋酸10ml，氯仿30ml,51,五.常用的固定方法浸泡法其他方法：蒸汽固定法：甲醛蒸汽 小而薄的组织、细胞 细胞涂片的固定方法 可采用浸入法和滴加法防摩擦脱落 防交叉污染 防混淆微波固定法：优点是核膜清晰，染色质均匀，组织收缩小；缺点是时间及温度(63-65 ) 不易控制 灌注固定法,加热蒸汽,52,组织固定后的冲洗
10、流水冲洗冲洗的时间与组织块的大小、固定时间的长短有关大标本24小时小标本 210小时,53,第 三 节,组织切片技术,54,脱水,透明,浸蜡,封固,制作切片的方法和程序,制作切片的主要过程,包埋,染色,切片,55,一、 脱 水某些溶剂置换组织内水分的过程 （一）目的石蜡切片组织中含大量水分水与石蜡不能混合必须脱去组织中的 水分,脱水必须干净彻底,!,56,（二）脱水剂 能够使组织脱水的化学物质称为脱水剂。 常用脱水剂；与水任意比例混合酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、环己酮,酒精,水,二甲苯,57,（三）脱水步骤和时间脱水时间和组织块大小有关，一般大小为1.81.8，厚约0.20.3的组织，其脱水步
11、骤和时间如下：70%酒精 12h 80%酒精 24h 90%酒精 24h 95%酒精 24h 95%酒精 24h无水酒精 24h 无水酒精 24h,递增酒精浓度可避免组织过度收缩,58,自动脱水机,59,(四) 脱水的注意事项组织脱水必须掌握由低浓度向高浓度逐步过渡的原则脱水时间要适度 组织脱水要彻底干净 酒精的浓度 适时更换 降级使用,！,60,二、 透明组织经酒精脱水后，还必须经过一个媒剂透明过程,既与酒精混合 又溶解于石蜡,酒精,石蜡,媒剂,使组织透明,61,常用透明剂二甲苯、甲苯、氯仿、香柏油等最常用 二甲苯（折光率1.497） 约30min,62,三 、 浸蜡经过透明的组织块，进一步
12、移入熔化的石蜡内浸渍，称为浸蜡。用其他浸透剂（火棉胶，碳蜡，明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入目的：使石蜡充分进入组织中，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块而便于切片,63,注意: 在浸蜡过程中，一般要2次或3次更换蜡缸 浸蜡时间，一般更换3次石蜡总共在3h左右 浸蜡在温箱中进行 温度！ 浸蜡用的石蜡要定期更新（降级使用）浸蜡用石蜡熔点较低,52-56,64,四、包 埋使用包埋剂将处理过的组织包于其中，使组织达到一定韧度和硬度，有利于切片。石蜡包埋法；快速石蜡包埋法等,65,66,包 埋,67,68,69,蜡块,70,71,组织芯片制作方法： 组织芯片又称组织微列阵，是将数十个、数百
13、个、乃至上千个小的组织片整齐的排列在某一载体上（通常是载波片）而成的微缩组织切片。制作：采用石蜡包埋法 优点：方法简单易操作各组织基本在同一平面蜡与组织融合较好，不会出现崩块现象较小的蜡块可以包埋较多的组织,附,72,五 石蜡切片组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。一般切成46 m ，特殊情况可切12 m优点：操作简便 、便于大批制作、便于長期保存,73,切片前的准备：高质量的蜡块和锋利的切片刀是保证切片质量的关键清洁的载玻片、恒温烤片装置、优质狼豪毛笔、弯嘴镊过程：切片、贴附、烤片,74,轮转式切片机,切片,75,76,组织漂烘仪,40, 蜡的熔点,6070 ,
14、贴片,77,切片的注意事项首先要求切片刀锋利，刀口无缺损，才能切出完整薄片蜡块四周在切片时应修切整齐，尤其是上、下缘，要求平行切片刀及蜡块都要固定牢靠，机身的各个部分及螺丝应予旋紧，不可产生震动，摇动切片机时，用力不能过猛，以保持机身平稳，防止震动切片刀倾角不宜过大或过小，以2030为佳石蜡过软或室温过高，切片易粘于切片刀上，或发生皱缩，此时可将蜡块置于水槽内冷冻后再切。反之，如室温过低或石蜡过 硬， 切不成片时，可在蜡块切面上哈气加温,78,附：冰冻切片,保存酶类和抗原活性，尤其是对热或有机溶剂耐受能力弱的酶及细胞表面抗原,术中快速病理诊断、某些特殊染色、某些免疫组织化学染色,原位分子杂交,
15、注意：用于切片形态学观察要注意防止冰晶形成-速冻,科学研究：RNA，DNA提取,79,普通染色HE 苏木精hematoxlin和伊红eosin染色常规染色 染色的目的：增加组织在显微镜下的分辨率 HE染色 主要用以显示各种组织、细胞的一般形态结构以及疾病过程中病变的发生、发展及修复的过程。,常规染色,特殊染色,80,（一）染色原理 1、细胞核染色原理：核酸阴离子+苏木素阳离子蓝色 2、细胞浆染色原理：蛋白质阳离子+伊红阴离子伊红色PH值低于蛋白质等电点 3、分化和蓝化作用：分化：1%盐酸脱去多余染液蓝化：弱碱性液体使苏木素处于蓝色离子状态而使细胞核染上蓝色,81,染色缸,染色架,82,全自动染
16、色机,83,（二）染液及溶液的配制 1、苏木精染液 染核苏木精染液的配制方法很多，如哈瑞（Harris）苏木精染液，埃利希（Ehrlich）苏木精染液，德拉菲尔德（Delafield）苏木精染液，迈耶（Mayer）苏木精染液，克拉兹（Carazzi）苏木精染液等。,84,2、伊红染液 染胞浆伊红染液的浓度为.。一般而言，其浓度低时，染色时间延长。可以是水溶液，也可以是醇溶液。,85,3、分化液a) 1%盐酸酒精溶液：盐酸1ml，70%酒精99mlb) 0.5%1%盐酸水溶液：盐酸0.51ml，加蒸馏水99ml以上两种溶液以1%盐酸酒精溶液最常用。,86,4、 弱碱性水溶液(1)碳酸锂水溶液：碳
17、酸锂1.25g溶于蒸馏水 100ml。PH值为8.0左右。(2)氢氧化铵水溶液：将氢氧化铵（氨水）逐滴加入蒸馏水中，经搅拌后，用pH试纸检验溶液，pH值调至7.58.0之间即可。【注意】以上两种“弱碱性水溶液：为返蓝剂，使苏木精染色返为蓝色。使用流水冲洗12h也可起到返蓝作用，因为自来水亦呈弱碱性。,87,（三）染色程序与方法 常规石蜡切片HE染色大体分三个步骤： 1、染色前切片脱蜡水洗染色剂为水溶性，水与石蜡不溶，在染色前必须将石蜡脱尽，否则不能染色。脱蜡时间宁长勿短。,二甲苯 脱蜡,酒精 洗去 二甲苯,水,88,步骤： （1）二甲苯5min（烘干切片浸入，脱蜡） （2）二甲苯15min（充
18、分溶解残存切片上石蜡） （3）无水酒精12min（洗去二甲苯） （4）无水酒精12min（彻底洗出二甲苯） （5）95%酒精12min （6） 85%酒精12min （7） 70%酒精12min（用各级酒精清洗切片中的二甲苯，同时切片逐步加水，不可直接由无水酒精入水，可致切 片漂浮脱落）。 （8）自来水洗12min （9）蒸馏水洗12min（使水充分进入切片有利于苏木素染液进入胞核）,89,2 、HE染色HE染色是先用苏木精染液将切片组织过染，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液返蓝。使胞核呈鲜明的蓝色，胞质及背景无色，再水洗后用伊红染胞质。,过 染 苏木素,水 洗 分 化,蓝 化,染 色
19、伊 红,90,步骤 （1） 苏木精染液15min （2） 自来水洗35min （3） 1%盐酸酒精815min （分化） （4） 自来水洗15min （5） 弱碱性水溶液3060s （蓝化） （6） 自来水洗510min(此时可在光镜下观察着色程度，如不适可作相应处理) （7） 蒸馏水洗12次 （8） 伊红水溶液510min （9） 蒸馏水洗12次（用水洗去未结合的染液）,91,3 脱水、透明、封固常规石蜡切片HE染色的组织切片，均以干性封固剂（中性树胶）封藏，便于观察和长期保存。,二甲苯 透明,酒精 脱水,水,封固,92,封固剂 使染色后的组织封固于载玻片与盖玻片 之间而不与空气直接接触，避
20、免氧化褪色；折光率与玻片的折光率相似。透明 用二甲苯使组织透明（折光率）以利光线通过。,93,步骤(1) 70%酒精12min (2) 0.5%伊红酒精溶液0.52min (3) 80%酒精12min (4) 95%酒精12min (5) 无水酒精15min (6) 无水酒精15min (7) 二甲苯石炭酸混合液12min (8) 二甲苯12min (9) 二甲苯12min (10) 中性树胶封固,94,染色注意事项1. 脱蜡水洗中的问题1） 脱蜡时间宁可长些，不应过短，否则脱蜡不尽，无法着色。2） 用各级酒精清洗切片中的二甲苯，同时使切片逐步加水。,95,2.染色时间问题（1）苏木精染色时间
21、 染色时间之长短不可能一成不变，与不同的组织，取材的新旧，组织固定液的不同，环境温度等有密切关系，因此染色时间必须根据实际情况灵活掌握。 （2）伊红染色时间 伊红染色程度应以苏木精对核着色程度为参照标准，以求达到对比鲜明。,96,3.分化问题分化处理恰当，即核的颜色达到适宜程度，应立即终止分化，经水洗，返蓝后，经显微镜观察，核膜及核染色质的形态结构特点显示清楚。为了控制好分化程度，操作中应注意如下问题： （1）盐酸酒精分化液浓度一般不易超过1% 。 （2）分化不足和分化过度都不能获得良好的切片 （3）操作中除肉眼观察大致确定切片着色和分化程度，还必须经光学显微镜下观察确定。,97,4. 染色后
22、的脱水透明及使用石炭酸二甲苯问题脱水所用的70%、80%、95%酒精，除有脱水作用外，还兼有对伊红染色的分化作用，最后通过无水酒精达到彻底脱水之目的。如果脱水不彻底或用脱水的各级酒精不纯，当切片从酒精移入二甲苯透明时，就会产生白色云雾，使切片呈现模糊不透明状态。二甲苯使用过久或混入水分也可出现同样现象。此时则应更换新液，即可消除。,98,在潮湿的环境下，透明困难，可使用石炭酸二甲苯混合液，因为石炭酸二甲苯有强烈的吸水和透明作用，使切片较清晰。但是最后必须用二甲苯彻底洗净石炭酸，因其酸性常易引起日后切片褪色。因此也可不用此液。,99,5. 封固问题 （1）中性树胶浓度：过稀容易溢出玻片的周围，当
23、树胶内的二甲苯挥发后，树胶干燥浓缩后产生气泡；中性树胶过浓稠，滴后不易扩散，如产生气泡不易排出。 （2）树胶的量：过多会溢出，而过少则封盖不全，影响切片保存。 （3）产生气泡，可轻轻加压驱除。或返回二甲苯内小心取下盖玻片重新封固 。,100,常规石蜡切片和HE染色标本的质量标准（全国统一标准）,切片完整，厚度46 m 厚薄均匀，无褶无刀痕 染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观,101,徐州医学院 病理教研室071234,盖玻片,载玻片,102,质量良好的切片,103,质量良好的切片,104,切片折叠,105,切片染色不良 刀痕,切片过厚,106,Masson 三色染色法,特殊染色（特染）,胶原纤维呈蓝色，肌纤维和红细胞呈红色，细胞核呈蓝褐色,如:显示结缔组织的纤维-Masson三色染色法、VG法、银染法糖原-PAS法,107,徐州医学院病理学教研室 徐州医学院附院病理科,108,下课,
