PCR技术的基本原理.doc

1、PCR 技术的基本原理：该技术是在模板 DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，借助一小段双链 DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链 DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3-OH 末端，并以此为起始点，沿模板 53方向延伸，合成一条新的 DNA 互补链。PCR 目录 PCR 原理 PCR 反应体系与反应条件 PCR 步骤 PCR 检测 PCR 反应特点 PCR 仪器 聚合酶链式反应(Polymerase Chain React

2、ion)，简称 PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的 DNA 片段。可看作生物体外的特殊 DNA 复制。DNA 聚合酶（DNA polymerase I）最早于 1955 年发现 ，而较具有实验价值及实用性的 Klenow fragment of E. Coli 则是于 70 年代的初期由 Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于 1976 年从 温泉中的细菌（ Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶

3、，但它被广泛运用则于 80 年代之后。PCR 最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于 1971 年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似 PCR 前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的 PCR 则于 1983 由 Dr. Kary B. Mullis 发展出的，Dr. Mullis 当年服务于PE 公司，因此 PE 公司在 PCR 界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于 1985 年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后 PCR 技术在

4、生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis 也因此获得了 1993 年诺贝尔化学奖。编辑本段PCR 原理DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在 DNA 聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA 聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的 DNA 聚

5、合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了 PCR 技术的应用和发展。发现耐热 DNA 聚合同酶-Taq 酶对于 PCR 的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受 90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使 PCR 技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR 技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物

6、结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火(复性) ：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。编辑本段PCR 反应体系与反应条件标准的 PCR 反应体系： 10扩增缓冲液

7、 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10100pmol 模板 DNA 0.12ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要 Mg2+)编辑本段PCR 步骤标准的 PCR 过程分为三步：1.DNA 变性（ 90-96 ）：双链 DNA 模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链 DNA2.退火（25 -65）：系统温度降低，引物与 DNA 模板结合，形成局部双链。3.延伸（70 -75）：在 Taq 酶（在 72左

8、右最佳的活性）的作用下，以 dNTP 为原料，从引物的 5端3端延伸，合成与模板互补的 DNA 链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA 含量既增加一倍。如图所示：现在有些 PCR 因为扩增区很短，即使 Taq 酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在 60-65间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。编辑本段PCR 检测PCR 反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年

9、来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。编辑本段PCR 反应特点特异性强PCR 反应的特异性决定因素为：引物与模板 DNA 特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及 Taq DNA 聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性) 可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的

10、，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。简便、快速PCR 反应用耐高温的 Taq DNA 聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在 DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在 24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及 RNA 均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、

11、细胞、活组织等 DNA 扩增检测。 PCR 的循环参数1、预变性（Initial denaturation）模板 DNA 完全变性对 PCR 能否成功至关重要，一般 95加热 3-5 分钟。2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对 PCR 的特异性有较大影响。3、引物延伸引物延伸一般在 72进行（Taq 酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中的变性步骤循环中一般 95，30 秒足以使各种靶 DNA 序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。5、循环数大多数 PCR 含 25-35 循环，过多易

12、产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后，反应在 72维持 5-15 分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。（四）PCR 中的污染和假阳性PCR 中污染主要来自1、样品间交叉污染；2、先前 PCR 产物遗留（carry-over）编辑本段PCR 仪器pcr 仪器的发展pcr 温度循环至关重要，pcr 扩增仪各参数必须准确。自 perkin elmer cetus 公司第一台pcr 扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售 pcr 扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。为了便于了解和选购适宜的

13、pcr 实验设备，现将部分国内外 pcr 扩增仪列表如下（表 22-5）；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产 1109 型 dna 扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b 体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式 pcr，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节 省劳动力的目的。在采用这些仪器作 pcr 试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用 eppendor

14、f 管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷 pcr 反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。国内外生产的几种 dna 扩增仪1109 型北京新技术所与军科院联合机械臂变温水浴电子调温400.5ml16400 元/台90a/b 型中科院遗传所机械臂变温水浴电热14000 元/台ptc-51a/b 型军事医学科学院变温气流电子调兼作套式300.5ml12000 元/台dna thermal cyclerperkin elmercetus(美)变温铝块压缩机致冷48

15、0.5mlus $ 20000.-thermocycler6000180bbraunbiotech(德)变温水浴 98四档电热,自来水冷却601.5ml1001.5ml1801.5mldm 30000.-automatic temperature cy-cler single block twin blockericomp inc.(美)变温铝块 25100电热,自来水冷却291.5ml581.5mlus $4985.-us $7980.-grant autogengrant instrumant ltd(美)变温水浴 099电热,自来水冷却或加冷循环器501.5mlor501.5mlus $

16、250. plusus $ 15.-forrack(x2)techne phc-1phc-2techne ltd.(英)变温铝块 099三档电热 500w 水冷 100w540.5ml540.5ml241.5ml3383. 3997. -bioovenbiothrm corp(美)变温气流-150115v 11a200s of 496plateus $ 2990. -trio-thermo-block tb-1biomertra(德) 半导体变温220v320 管分别控温dm12900. -micro cycler eeppendorf(美 ) 变温铝块220v/100v329 管us $ 3

17、500. -PCR 常见问题PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有 Taq 酶抑制剂， 模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜

18、随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度

19、低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul 。或 100ul，应用多 大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对 P

20、CR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 P

21、CR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。出现非特

22、异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65 左右退火与延伸) 。出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带

23、或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。克隆 PCR 产物1)克隆 PCR 产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8 或 8：1 也行。应测定比值范围。连接用 5ul 2X 连接液 , 50ng 质粒 DNA,1Weiss 单位的 T4 连接酶，插入片段共 10ul。室温保温 1 小时，或 4过夜。在这 2 种温度下，缺 T-凸出端的载体

24、会自连，产生蓝斑。室温保温 1 小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需 4过夜。2)PCR 产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将 1ug/ul 质粒 1:100 稀释,1ul 用于 100u

25、l 感受态细胞转化。用 SOC 稀释到1000ul 后，用 100ul 铺板。培养过夜，产生 1000 个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板 DNA 的总量。铺板 DNA 的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用 10ng DNA，用SOC 稀释到 1000u 后含 10 ng DNA，用 1/10 铺板，共用 1 ng DNA。转化率为：1000 克隆 X10（3 次方） ng /铺板 1 ng DNA ug=10（6 次方）cfu/ ug转化 pGEM-T 应用 10（8 次方）cfu/ ug 感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用 pGEM-T

26、正对照，或 PCR 产物，产生20-40 蓝斑（用指定步骤 10（8 次方）cfu/ ug 感受态细胞），表明载体失去 T。可能是连接酶污染了核酸酶。 T4 DNA 连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的 T4 DNA 连接酶替换。D）用 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体，连接 pGEM-T 正对照，转化高频率感受态细胞（10（8 次方）cfu/ug ）,按照指定的实验步骤，可得 100 个菌落，其中 60%应为白斑，如产生20-40 蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

27、A）连接用室温保温 1 小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需 4过夜。B）插入片段带有污染，使 3-T 缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T 正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体 3-T 缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受 UV 过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA 必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热 DNA 聚合酶的扩增产物末端无 A，后者是 pGEM-T 或 pGEM-T Easy 载体克

28、隆所需。加 Taq DNA 聚合酶和核苷酸可在末端加 A。详情查 pGEM-T pGEM-T Easy 载体技术资料（TM042）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 SURE 细胞PCR 反应体系与反应条件标准的 PCR 反应体系：10扩增缓冲液 10ul4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L引物 各 10100pmol 模板 DNA 0.12ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物

29、、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免

30、引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度 0.11umol 或 10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应

31、， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50200umol/L，尤其是注意4

32、 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时( 偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细

33、胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+ 浓度为 1.52.0mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR 反应条件的

34、选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性- 退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 9095 变性，再迅速冷却至 40 60 ，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 7075，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100300bp 时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94变性，65左右退火与延伸(此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下，

35、9394min 足以使模板 DNA 变性，若低于 93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择

36、合适的温度：Tm 值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm 值-(510)在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性：7080 150 核苷酸/S/ 酶分子70 60 核苷酸/S/酶分子55 24 核苷酸/S/酶分子高于 90时， DNA 合成几乎不能进行。PCR 反应的延伸温度一般选择在 7075之间，常用温度为 72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够 的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。