1、CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制1教学目的：了解常用的分离方法，如沉淀分离法、萃取分离法、离子交换分离法和液相色谱分离法；气浮分离法和一些新的分离和富集方法简介作为选学内容。 教学重点：萃取分离法、离子交换分离法和液相色谱分离法。 教学难点：萃取分离法、离子交换分离法和液相色谱分离法的分离原理。 8.1 概 述在定量分析中，共存组分的干扰一般可通过控制分析条件或采用掩蔽法来消除。若仍无法解决问题时，就需要将测定组分与干扰组分分离。对于待测组分含量较低时，须先进行富集。富集过程也是分离过程。 对分离的要求是分离要完全，即被测组分的损失要小至可以忽略不计，干扰组分不再干扰被测组分的测定
2、。被测组分的损失，可用回收率来衡量。 （8-1） 对回收率的要求随被测组分的含量不同而不同： 被测组分大于%：回收率应大于 99.9%； 被测组分在 0.01%1%之间：回收率应大于 99%； 被测组分低于 0.01%（痕量组分）：回收率在 90%95%，有时可更低些。 8.1.1 沉淀分离法 1、常量组分的沉淀分离 主要的方法有： 氢氧化物沉淀分离 a. 氢氧化钠法：可使两性元素与非两性元素分离。但一般得到的氢氧化物沉淀为胶体沉淀，共沉淀严重，分离效果并不理想。如用“小体积沉淀法” 可改善沉淀的性质，提高分离效率。 小体积沉淀法是在尽量小的体积和尽量大的浓度，同时加入大量没有干扰的盐类下进行
3、。这样形成的沉淀含水量少，结构紧密。 b. 氨水法：在铵盐存在下，加入氨水调节和控制 pH 为 89，可使高价金属离子（如 Fe3+、Al 3+等）与大部分一、二价金属离子分离。加入铵盐的作用为：控制溶液的 pH 为 8-9，防止 Mg(OH)2 沉淀和减少 Al(OH)3 的溶解；大量 NH4+作为抗衡离子，减少氢氧化物对其它金属离的吸附；大量存在的电解质促进了胶体的凝聚。 c. 有机碱法：六亚甲基四胺、吡啶、苯胺、苯肼等有机碱，与其共轭酸组成缓冲溶液，可控制溶液的 pH 值，使某些金属离子生成氢氧化物沉淀。 d. ZnO 悬浊液法：在酸性溶液中加 ZnO 悬浊液，ZnO 与酸作用逐渐溶解，
4、使溶液的 pH 提高，达到平衡后，可使溶液的 pH 约为 6，使一部分氢氧化物沉淀。 硫化物沉淀分离 硫化物沉淀分离是根据各种硫化物的溶度积相差比较大的特点，通过控制溶液的酸度来控制硫离子浓度，而使金属离子相互分离。 其它无机沉淀剂：如硫酸、HF 或 NH4F、磷酸。 利用有机沉淀剂进行分离：如草酸等。 2、痕量组分的共沉淀分离和富集 在重量分析中，共沉淀现象是一种消极因素，在分离方法中，却能利用共沉淀现象来分离和富集微量组分。 加入CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制2某种离子与沉淀剂生成沉淀作为载体，将痕量组分定量地沉淀下来，再将沉淀溶在少量溶剂中，以达到分离和富集的目的。 无机共
5、沉淀剂 a. 利用表面吸附进行共沉淀： CuS 可将 0.02ug 的 Hg2+从 1L 溶液中沉淀出 b. 利用生成混晶进行共沉淀。 有机共沉淀剂 灼烧时共沉淀剂易除去，吸附作用小，选择性高，相对分子质量大，体积也大，分离效果好. a. 利用胶体的凝聚作用进行共沉淀：辛可宁，丹宁，动物胶 b. 利用形成离子缔合物进行共沉淀：甲基紫，孔雀绿，品红，亚甲基蓝 c. 利用“ 固体萃取剂”进行共沉淀： 8.1.2 挥发和蒸馏分离法 挥发和蒸馏分离法是利用物质的挥发性的差异进行分离的一种方法，可以除去干扰组分，也可使被测组分定分出后进行测定。 无机物中具有挥发性的物质不多，因此这种方法的选择性高。砷的
6、氢化物，硅的氟化物，锗、砷、锑、锡的氯化物都具有挥发性，可控制不同的馏出温度将其蒸出，用合适的吸收液吸收，便能进行测定。 在有机分析中，也常用挥发和蒸馏分离法。例如 C，H，O，N，S 等元素的测定等。无论是无机物还是有机物中氮的测定，都是将化合物中的氮经一定处理转化为 NH4+，然后在浓碱存在下将 NH3 蒸出并用酸吸收后进行测定。 8.2 液-液萃取分离法液-液萃取分离法又称溶剂萃取分离法，简称萃取分离法。 萃取：把某组分从一个液相(水相) 转移到互不相溶的另一个液相(有机相) 的过程。 试液组分(水相) + 有机溶剂 水相( 一些组分) + 有机相( 一些组分) 分离 反萃取：有机相水相
7、 8.2.1 萃取分离法的基本原理 1、萃取过程的本质 萃取过程的本质就是将物质由亲水性转化为疏水性的过程。 亲水性：易溶于水而难溶于有机溶剂的性质。金属离子在水中形成水合离子，具有亲水性，常见亲水基团有：OH，SO 3H，NH 2，NH。 疏水性：难溶于水而易溶于有机溶剂的性质。常见疏水基团有：烷基，卤代烷基，芳香基。 物质含亲水基团越多，其亲水性越强。 物质含疏水基团越多，其疏水性越强。 2、分配系数和分配比 a. 分配系数 一定温度下，溶质 A 在水相和有机相达到平衡，如果溶质 A 在两相中存在的型体相同，如： A(水) CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制3A(有) 则 （8-
8、2） 此式称为分配定律，K D 称为分配系数，在给定的温度下，K D 是一常数。 分配定律适用条件： 1.稀溶液，可用浓度代替活度；2.溶质在两相中均以单一的相同形式存在，没有其他副反应。 b. 分配比 当溶质在水相和有机相中具有多种存在形式时，分配定律不适用。 （8-3） D 称为分配比。 当 D1 时，说明溶质进入有机相的量比留在水中的量多。 在两相中以单一形式存在，溶液较稀时，K DD 。 分配比并不是常数，与溶液的酸度、溶质的浓度等因素有关。 3、萃取百分率 萃取百分率 E 表示萃取的完全程度。 （8-4 ） E 与 D 的关系为： （8-5 ） 当用等体积溶剂进行萃取时，即 VW=V
9、O 时，则 （8-6 ） 上式说明，当 VW=VO 时，若 D=1，萃取一次的萃取百分率为 50%；若要求萃取率大于 90%，则 D必须大于 9；当分配比不高时，可采用多次连续萃取的方法来提高萃取率。 设 VW（mL）溶液内含有被萃取物m0(g)，用 VO(mL)溶剂萃取一次，水相中剩余被萃取物 m1(g)，则进入有机相的质量是(m 0-m1)(g)，此时分配比为： 故 若用 VO（mL）溶剂，萃取 n 次，水相中剩余被萃取物为 mn（g ），则： （8-7） 同量的萃取溶剂，分几次萃取的效率比一次萃取的效率高。但增加萃取次数，会增加萃取操作的工作量，影响工作效率。 8.2.2 重要的萃取体系
10、 1.螯合物萃取体系 用于金属阳离子的萃取。 2.离子缔合物萃取体系 离子缔合物阳离子和阴离子通过静电引力结合形成的电中性化合物。 a.金属阳离的离子缔合物 b.金属络阴离子或无机酸根的离子缔合物 CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制43.溶剂化合物萃取体系 溶剂化合物溶剂分子通过其配位原子与无机化合物中金属离子相键合而形成的化合物。 4. 简单分子萃取体系 某些无机化合物，如 I2，Cl 2，Br 2,GeCl4，AsI 3，SnI 4，OsO 4 等。 8.2.3 萃取条件的选择 1、螯合剂的选择 螯合剂要与金属离子生成稳定的螯合物，含疏水基团多，亲水基团少。 2、溶液的酸度 溶液
11、的酸度越低，则 D 值越大，就越有利于萃取。但酸度太低，金属离子可能水解，或引起其它副反应。 3、萃取剂的选择 相似相溶 4、干扰离子的消除 控制酸度；使用掩蔽剂 8.2.4 萃取分离技术 1.萃取方式：单级萃取、多级萃取、连续萃取 2.分层 3.洗涤：洗涤剂的组成与试液相同，但不含试样。 4.反萃取：有机相水相 溶剂萃取在分析化学中的应用：萃取分离；萃取富集；萃取比色。 8.3 离子交 换分离法离子交换分离法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间发生交换反应来进行分离的方法。 离子交换分离法实质是：使离子交换亲和力差别很小的待测组分在反复的交换洗脱过程中得到放大，从而在宏观上造成它们在交换柱中迁
12、移速度上的差别, 使之分离。它既可分离不同电荷的离子，也可分离相同电荷的离子。但是操作较麻烦，周期长。 离子交换分离法可用于：分离；富集微量物质；除去杂质，高纯物质的制备（去离子水）。 8.3.1 离子交换剂的种类和性质 1、离子交换剂的种类 离子交换剂主要分为无机离子交换剂和有机离子交换剂。目前应用较多的是有机离子交换剂。 有机离子交换剂又称离子交换树脂，具有网状结构，有骨架上有可以与溶液中的离子起交换作用的活性基团，如SO 3H，COOH，NOH 等。按性能可分为七类，如阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，螯合树脂，大孔树脂，氧化还原树脂，萃淋树脂，纤维树脂等。现主要介绍应用最广的阳离子交换树
13、脂和阴离子交换树脂。 a. 阳离子交换树脂：活性交换基团为酸性基团，它的阳离子可被溶液中的阳离子交换。 强酸型：活性基团：-SO 3H，在酸性、中性和碱性溶液中都能使用，如国产#732 树脂。 弱酸型：活性基团：-COOH，-OH ，在中性、碱性中使用，如国产#724 树脂。 b. 阴离子交换树脂：活性交换基团为碱性基团，它的阴离子可被溶液中的阴离子交换。 强碱型：活性基团为季胺基N(CH 3)3Cl，在酸性、中性和碱性溶液中都能使用，如国产#717 树脂。 弱碱型：活性基团为伯胺基（NH 2）、仲胺基（NH）或叔胺基（N）基团，在中性和酸性溶液中使用，如国产#701 树脂。 2、离子交换树脂
14、的结构 离子交换树脂为具有网状结构的高分子聚合物。例如，常用的聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂，就是以苯乙烯和二乙烯苯聚合后经磺化制得的聚合物。 CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制53、交联度和交换容量 a. 交联度：指树脂中含交联剂（如二乙烯苯）的质量分数。是树脂的重要性质之一。 交联度小：网眼大，对水膨胀性好，交换速度快，选择性差，机械性能差。 交联度大：网眼小，对水膨胀性差，交换速度慢，选择性好，机械性能高。 树脂的交联度一般以414为宜。 b. 交换容量：指每克干树脂所能交换的一价离子的物质的量(mmol) 。是树脂性质的另一指标。它决定于树脂网状结构内所含活性基团的数目。一般树
15、脂的交换容量为 3-6mmol/g。 8.3.2 离子交换树脂的亲和力 离子交换树脂对离子的亲和力反映了离子在离子交换树脂上的交换能力。离子交换的交换反应可用下式表示： RA + + B+ RB + + A+ 在上交换反应中，树脂 R与 B+的静电吸引力大于 R与 A+的吸引力，这种静电吸引力又称树脂对离子的亲和力。 离子交换树脂的亲和力与水合离子的半径、电荷及离子的极化程度有关。 离子半径：水合离子半径越小，亲和力越大； 离子电荷：电荷越高，亲和力越大； 例如，对于碱金属离子： 水合离子半径： Li +Na +K + 树脂的亲和力： Li +CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制6Na
16、+K + 交换到树脂的顺序：K +Na +Li + 从树脂洗脱的顺序： Li+Na +K + 8.3.3 离子交换分离操作 1.树脂的处理和装柱 用水浸泡溶胀后盐酸浸泡洗至中性 装柱：将离子交换树脂装入交换柱内。 2交换：以一定速度由上向下经柱交换，“交界层”下移，离子中亲和力大的在上层，每种离子集中在柱的某以区域。 3.洗脱：洗脱( 淋洗)就是将交换到树脂上的离子，用洗脱剂(或淋洗剂)置换下来的过程，是交换过程的逆过程。在洗脱过程中，亲和力最小离子的先被洗脱下来，亲和力最大的离子最后被洗脱下来。 CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制74 树脂再生：将树脂恢复到交换前的形式。有时洗脱过
17、程就是再生过程。 一般阳离子树脂用mol.L -1HCl 浸泡，将其转为 H+型；阴离子交换树脂用 1mol.L-1NaOH 浸泡，转为 OH-型。 8.3.4 离子交换分离法的应用 1 、水的净化 水（含阳离子、阴离子杂质）强酸型阳离子交换树脂（H +型）强碱型阴离子交换树脂（OH -型）H 2O 2、微量组分的富集 矿石中痕量 Pt 和 Pd PtCl62-、PdCl 42- Cl-型强碱型阴离子交换树脂 PtCl62-、PdCl 42-交换到树脂上 灰化树脂 王水浸取 光度法测定 3、阴阳离子的分离 Fe 3+、HSO 4- 阳离子交换树脂 Fe3+被树脂吸附 HSO4-流出 4、相同电
18、荷离子的分离 如 Li+、Na +、K +的分离。 8.4 液相色 谱分离法CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制8色谱法又称层析法或色层法。 色谱法是根据不同的物质在流动相与固定相的分配比不同而使物质分离的方法。由于各组分受到两相的作用力不同，从而使各组分以不同的速度移动，达到分离的目的。 色谱法包括液相色谱法和气相色谱法。这里只简单介绍属于经典的液相色谱法的纸上色谱法、薄层色谱法和萃取色谱法。 8.4.1 纸上色谱分离法 载体：层析滤纸； 固定相：滤纸上吸附的水分（约为纸质量的 20%）； 流动相：展开剂（有机溶剂）。 由于毛细管作用，展开剂从下而上流动，被分离的物质在展开剂和固定相
19、之间连续不断地分配，相当一起连续多次的萃取。 组分上升的速度：分配比大的上升快，分配比小的上升慢，从而互相分离。 显色后，测定比移值(R f)：R f = a/b 定性分析：根据比移值判断，不同的物质有不同的比移值。 定量分析：与相同条件下的标准色比较，或将斑点剪下，用试剂溶解后测定。 纸层析分析法(动画) 有机酸的纸层析色谱法( 实验视频) 8.4.2 薄层色谱分离法 载体：玻璃板； 固定相：吸附剂粉末铺成薄层作为固定相，吸附剂常为纤维素、硅胶、活性氧化铝等。 流动相：展开剂。 薄层色谱分离法是利用吸附剂对不同组分的吸附力的差异，造成它们在薄层上迁移速度的差别，从而得到分离，它形同纸上色谱，
20、实同柱中层析，其比移值的计算同纸上色谱，它与纸上色谱相比具有速度快、灵敏度高、操作简便、应用广泛、显色方法多等特点。 展开时，试样沿着吸附层不断地发生：溶解吸附再溶解再吸附的过程，易被吸附的物质移动得慢些，较难被吸附的物质移动得快些，经过一段时间后，不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点，从而达到分离。 薄层色谱法是一种吸附层析,需利用各种不同极性的溶剂来配CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制9制适当的展开剂。 吸附剂和展开剂的一般选择原则是：非极性组分的分离，选用活性强的吸附剂，用非极性展开剂；极性组分的分离，选用活性弱的吸附剂，用极性展开剂。 半定量分析：与相同条件下标准物质
21、的斑点面积和颜色比较； 定量分析：将斑点刮下，溶解后测定，还可用光度计或荧光计直接测定斑点的吸光度或荧光强度，以确定含量。 薄层色谱分离法(动画) 薄层色谱法(实验视频) 8.4.3 反相分配色谱分离法 载体：色谱柱； 固定相：有机相； 流动相：水相。 试液 色谱柱 组分集中在柱的上层 洗脱 各组分在两相间多次进行萃取-反萃取- 萃取 洗脱液（组分分离） 如 Th() 、Zr( )和 UO22+的分离： 8.5 气浮分离法采用某种方式，向水中通入大量微小气泡，在一定条件下，使呈表面活性的待分离物质吸附或粘附于上升的气泡表面而浮升到液面，从而使某组分得以分离的方法。它主要是表面活性剂的加入，其极
22、性端与水相中的离子或极性分子通过物理或化学作用结合在一起，当通入气泡时，表面活性剂就将这些物质连在一起定向排列在气液界面，被气泡带到液面，形成泡沫层，达到分离。 气浮分离法包括离子气浮法、沉淀气浮法、溶剂气浮法三种类型。生物分离的基本概念 本文来自：博研联盟论坛 生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 生物分离过程的主要特点 本文来自：博研联盟论坛 CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制10常无固定操作方法可循 本文来自：博研联盟论
23、坛 生物材料组成非常复杂 本文来自：博研联盟论坛 分离操作步骤多，不易获得高收率 本文来自：博研联盟论坛 培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高 本文来自：博研联盟论坛 分离进程必须保护化合物的生理活性 本文来自：博研联盟论坛 生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏 本文来自：博研联盟论坛 基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟生物分离的一般工艺流程 本文来自：博研联盟论坛 发酵液预处理细胞分离（ 细胞破碎细胞碎片分离 ） 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 初步纯化高度
24、纯化成品加工 本文来自：博研联盟论坛 注：（1）胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化。 本文来自：博研联盟论坛 （ 2）在初步纯化及其以前的各步操作，处理的体积较大，着重于浓缩，称为提取或分离；以后各步为精细的分离操作，着重于纯化，称为精制（或纯化） 。 本文来自：博研联盟论坛 生物分离的各阶段的常用方法 本文来自：博研联盟论坛 （1）发酵液的预处理 本文来自：博研联盟论坛 n 加热 本文来自：博研联盟论坛 n 调 pH 本文来自：博研联盟论坛n 絮凝和凝聚 本文来自：博研联盟论坛 （2 ）固液分离 本文来自：博研联盟论坛 n 沉降 本
25、文来自：博研联盟论坛 n 离心分离 本文来自：博研联盟论坛 n 过滤 本文来自：博研联盟论坛 n 错流过滤 本文来自：博研联盟论坛 （3）细胞破碎 本文来自：博研联盟论坛 n 机械法 本文来自：博研联盟论坛 高压匀浆、高速珠磨、 本文来自：博研联盟论坛 超声波破碎 本文来自：博研联盟论坛 n 非机械法 本文来自：博研联盟论坛 化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法 本文来自：博研联盟论坛 （4 ）初步纯化 本文来自：博研联盟论坛 n 沉淀法 本文来自：博研联盟论坛 n 吸附法 本文来自：博研联盟论坛 n 萃取法 本文来自：博研联盟论坛 n 超滤法 本文来自：博研联盟论坛 （5）高度纯
26、化 本文来自：博研联盟论坛 CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制11n 层析 本文来自：博研联盟论坛 亲和层析、凝胶层析、离子交换层析 本文来自：博研联盟论坛 n 电泳 本文来自：博研联盟论坛 n 结晶和重结晶 本文来自：博研联盟论坛 （6 ）成品加工 本文来自：博研联盟论坛 n 无菌过滤 本文来自：博研联盟论坛 n 去热原 本文来自：博研联盟论坛 n 干燥 本文来自：博研联盟论坛 冷冻干燥、喷雾干燥 本文来自：博研联盟论坛 n 制剂 本文来自：博研联盟论坛 生物分离方法的选择依据 本文来自：博研联盟论坛 n 传统生物药物（抗生素） 本文来自：博研联盟论坛 根据具体条件，通过小实验决定
27、，选择时应考虑两个因素。 本文来自：博研联盟论坛 （1）抗生素的理化性质：极性、酸碱性、溶解度等，了解其理化性质，通常利用纸层析和纸电泳的方法。本文来自：博研联盟论坛（2）抗生素的稳定性：要了解它在什么样的 pH 和温度范围易受破坏。 本文来自：博研联盟论坛 纸层析 本文来自：博研联盟论坛 抗生素在某一种溶剂中的 Rf 值大，表明它在该种溶剂中溶解度大；相反，如 Rf 值小，则溶解度小。如 Rf 为零，则说明不能溶解。如抗生素在极性强的溶剂中有较大的 Rf 值，则表明该抗生素是极性化合物；而非极性抗生素在非极性溶剂中 Rf 值较大，在极性溶剂中 Rf 值较小。 本文来自：博研联盟论坛 纸电泳
28、本文来自：博研联盟论坛 通过纸层析判断为水溶性的抗生素，可用纸电泳法进一步判断其电离性质。 本文来自：博研联盟论坛 电泳结果与样品性质的判断见课本第六页表 1-1。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 生物分离方法的选择依据 本文来自：博研联盟论坛 基因工程药物 本文来自：博研联盟论坛 应根据目标蛋白和杂蛋白在物理、化学和生物化学方面性质的差异，如，生物特异性、分子量、等电点值和稳定性等。当几种方法联用时，最好以不同的分离机理为基础，且前一种方法处理过的液体应能适于后一种方法的料液。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 发酵液（培养液）的预处理
29、本文来自：博研联盟论坛 预处理的目的 本文来自：博研联盟论坛 改变发酵液（培养液）的物理性质，以利于固液分离。主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂。 本文来自：博研联盟论坛 去除发酵液（培养液）中部分杂质以利于后续各步操作。 本文来自：博研联盟论坛 预处理的方法 本文来自：博研联盟论坛 一、加热 本文来自：博研联盟论坛 加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液（培养液）加热到所需温度并保温适当时间。加热能使CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制12杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液（培养液）的粘度，使固液分离变得容易。但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质。 本文来自：博研联盟论坛
30、预处理的方法 本文来自：博研联盟论坛 二、凝聚和絮凝 本文来自：博研联盟论坛 凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物） 、细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。其处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液（或培养液） ，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。 本文来自：博研联盟论坛 1凝聚 本文来自：博研联盟论坛 凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。 本文来自：博研联盟
31、论坛 凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷） ，因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂有：Al2（SO4）3?18H2O（明矾） 、AlCl3?6H2O、FeCl3 、ZnSO4、MgCO3 等；常用的金属氧化物类凝聚剂有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2 或石灰等。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 2絮凝 本文来自：博研联盟论坛 絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质） ，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。 本文来自：博研联盟论坛
32、 常用的絮凝剂有聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、 、聚丙烯酸钠和聚苯乙烯磺酸。 本文来自：博研联盟论坛 影响絮凝效果的因素很多，主要是絮凝剂的分子量，絮凝剂用量，溶液 pH，搅拌速度和时间等。 本文来自：博研联盟论坛 三、使用惰性助滤剂 本文来自：博研联盟论坛工业生产中有时需加入某些固体物质，以加速过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂 本文来自：博研联盟论坛 助滤剂的使用方法有两种：在过滤前先在过滤介质表面预涂（铺）一层助滤剂。助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中。 本文来自：博研联盟论坛 常用的惰性助滤剂有硅藻土、珍珠岩、混合助滤剂（硅藻土或珍珠岩与石棉） 、纤维素和活性炭。
33、 本文来自：博研联盟论坛助滤剂的选择要点如下： 本文来自：博研联盟论坛（1）粒度选择 本文来自：博研联盟论坛 （2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂的品种 本文来自：博研联盟论坛 （3）用量选择 本文来自：博研联盟论坛 四、去除杂蛋白质的其它方法 本文来自：博研联盟论坛 1等电点沉淀 本文来自：博研联盟论坛 蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。 本文来自：博研联盟论坛 2变性沉淀 本文来自：博研联盟论坛 使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变 pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等） 、加重金属离子如 Ag 、Cu2 、Pb2 等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。
34、 本文来自：博研联盟论坛 3吸附 本文来自：博研联盟论坛 CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制13在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。 本文来自：博研联盟论坛 预处理的方法 本文来自：博研联盟论坛 五、不溶性多糖的去除 本文来自：博研联盟论坛 当发酵液中含有较多不溶性多糖时，粘度增大，液固分离困难，可用酶将它转化为单糖以提高过滤速度。例如在蛋白酶发酵液加 淀粉酶，将培养基中多余的淀粉水解称单糖，就能降低发酵液粘度，提高滤速。本文来自：博研联盟论坛 预处理的方法 本文来自：博研联盟论坛 六、高价金属离子的去除 本文来自：博研联盟论坛 对提取和
35、成品质量影响较大的无机杂质主要是 Ca2、 Mg2、Fe3 等高价金属离子，预处理中应将它们除去。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 细胞破碎 本文来自：博研联盟论坛 一、概念 本文来自：博研联盟论坛 破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放。 本文来自：博研联盟论坛 二、影响细胞破碎的因素 本文来自：博研联盟论坛 1、细胞壁的结构 本文来自：博研联盟论坛 2、破碎方法 本文来自：博研联盟论坛 细胞壁的结构 本文来自：博研联盟论坛 细菌 本文来自：博研联盟论坛 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约 2080nm）组成 ，而革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅23nm，在肽聚糖层
36、外还有两层外壁层。外壁层约 810nm，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎。 本文来自：博研联盟论坛 霉菌 本文来自：博研联盟论坛 霉菌的细胞壁较厚，约 100 250nm。 本文来自：博研联盟论坛 酵母菌 本文来自：博研联盟论坛 酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 破碎方法 本文来自：博研联盟论坛 机械法 本文来自：博研联盟论坛 高压匀浆法 本文来自：博研联盟论坛 高速珠磨法 本文来自：博研联盟论坛 超声波破碎法 本文来自：博研联盟论坛 非机械法 本文来自：博研联盟论坛 化学法 本文来自：博研联盟论坛 酶解法 本文来自：博研联盟
37、论坛 物理法：渗透压冲击法、冻融法 本文来自：博研联盟论坛 干燥法 本文来自：博研联盟论坛 1、非机械法 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制14A、高压匀浆法 本文来自：博研联盟论坛 适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。 本文来自：博研联盟论坛 B、高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎。 本文来自：博研联盟论坛 C、超声波破碎法：实验室常用 本文来自：博研联盟论坛 影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 2、非
38、机械法 本文来自：博研联盟论坛 A、化学法：采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 B、酶解法 本文来自：博研联盟论坛 利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的。需与其它方法配合使用（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等） 本文来自：博研联盟论坛 途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用 本文来自：博研联盟论坛 自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它的酶 本文来自：博研联盟论坛 自溶的方法： 本文来自：博研联盟论坛 加热法、干燥法 本文来自：博研联盟论坛 C、渗透压冲击法 本文
39、来自：博研联盟论坛 先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂。 本文来自：博研联盟论坛 D、冻结- 融化法 本文来自：博研联盟论坛 将细胞放在低温（-150C） ，然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 E、干燥法 本文来自：博研联盟论坛经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。 本文来自：博研联盟论坛 方
40、法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 三、破碎率的评价 本文来自：博研联盟论坛 细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： 本文来自：博研联盟论坛 Y(%)=(N0-N)/N0100 本文来自：博研联盟论坛N0原始细胞数量 本文来自：博研联盟论坛 N经 t 时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 目前 N0 和 N 主要通过下面的方法获得 ： 本文来自：博研联盟论坛 直接计数法 本文来自：博研联盟论坛 在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。 本文来自：博
41、研联盟论坛 间接计数法 本文来自：博研联盟论坛 间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等） 。通过CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制15做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片） ，然后用 Lowry 法测量上清中的蛋白质含量。 本文来自：博研联盟论坛 四、各种破碎方法的评述 本文来自：博研联盟论坛 高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模
42、的细胞破碎。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性. 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 五、破碎方法的选择依据 本文来自：博研联盟论坛 处理量 本文来自：博研联盟论坛 高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产 本文来自：博研联盟论坛 产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置 本文来自：博研联盟论坛 生化物质的稳定性 本文来自：博研联盟论坛 细胞的
43、数量和细胞壁的强度 本文来自：博研联盟论坛 破碎程度 本文来自：博研联盟论坛 提取分离的难易 本文来自：博研联盟论坛 总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 第三节 固液分离 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 固液分离：是指将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。 本文来自：博研联盟论坛 一、固液分离设备 本文来自：博研联盟论坛 过滤设备 本文来自：博研联盟论坛 板框压滤机 本文来自：博研联盟论坛 真空鼓式过滤机 本文来自：博
44、研联盟论坛 离心设备 本文来自：博研联盟论坛 过滤式离心机 本文来自：博研联盟论坛 沉降式离心机 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 1、过滤设备 本文来自：博研联盟论坛 板框过滤机 本文来自：博研联盟论坛 原理 本文来自：博研联盟论坛 特点 板框压滤机的过滤面积大，能耐受较高压力差，对不同过滤特性的料液适应性强，同时还具有结构简单，造价较低，动力消耗少等优点。但这种设备不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（包括解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等） 。 本文来自：博研联盟论坛 CJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制16适用对象 广泛应用与培养基制备的过滤及霉
45、菌、放线菌和酵母菌和细菌等多种发酵液的过滤 。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 2、离心设备 本文来自：博研联盟论坛 过滤式离心机 本文来自：博研联盟论坛 转鼓上开有小孔，转鼓内表面覆盖过滤介质，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经小孔流出，固体被截留在过滤介质表面。主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量高的场合。 本文来自：博研联盟论坛 沉降式离心机 本文来自：博研联盟论坛 转鼓上无小孔，不需要过滤介质，在离心力的作用下，固体沉降于鼓壁上，余下的即为澄清的液体。适用于固体量较低（小于 10）的场合。常用的沉降式离心机有碟式离心机和管式离心机。 本文来
46、自：博研联盟论坛 二、过滤方式 本文来自：博研联盟论坛 常规过滤 本文来自：博研联盟论坛 料液流动方向与过滤介质（能使固液混合料液得以分离的某一介面）垂直。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 错流过滤 本文来自：博研联盟论坛 料液流向平行于过滤介质。过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。 本文来自：博研联盟论坛 本文来自：博研联盟论坛 三、影响固液分离的因素 本文来自：博研联盟论坛 微生物种类 本文来自：博研联盟论坛 真菌的菌体大，固液分离容易，可采用鼓式真空过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要采用一些手段增大粒子。 本文来自：博研联盟论坛 发酵液黏度 本文来自：
47、博研联盟论坛 固液分离速度与黏度成反比 本文来自：博研联盟论坛 其它因素 本文来自：博研联盟论坛 发酵液的 PH 值、温度和加热时间 本文来自：博研联盟论坛 四、固液分离的发展动向 本文来自：博研联盟论坛 改善固液分离的手段主要从下列三方面进行： 本文来自：博研联盟论坛 利用错流过滤 本文来自：博研联盟论坛 利用遗传工程的方法来改变菌体的大小和形状 本文来自：博研联盟论坛 采用双水相萃取处理细胞匀浆液06.0710分子筛催化剂1. 分子筛的概念分子筛是结晶型的硅铝酸盐，具有均匀的孔隙结构。分子筛中含有大量的结晶水，加热时可汽化除去，故又称沸石。自然界存在的常称沸石，人工合成的称为分子筛。它们的
48、化学组成可表示为Mx/n(AlO2)x(SiO2)y ZH2OCJ 希杰（聊城）生物科技有限公司研究所精制17式中 M 是金属阳离子，n 是它的价数，x 是 AlO2 的分子数，y 是 SiO2 分子数，Z 是水分子数，因为AlO2 带负电荷，金属阳离子的存在可使分子筛保持电中性。当金属离子的化合价 n = 1 时，M 的原子数等于 Al 的原子数；若 n = 2，M 的原子数为 Al 原子数的一半。常用的分子筛主要有：方钠型沸石，如 A 型分子筛；八面型沸石，如 X-型，Y-型分子筛；丝光型沸石（-M 型） ；高硅型沸石，如 ZSM-5 等。分子筛在各种不同的酸性催化剂中能够提供很高的活性和不寻常的选择性，且绝大多数反应是由分子筛的酸性引起的，也属于固体酸类。近 20 年来在工业上得到了广泛应用，尤其在炼油工业和石油化工中作为工业催化剂占有重要地位。2.分子筛的结构特征（1）四个方面、三种层次：分子筛的结构特征可以分为四个方面、三种不同的结构层次。第一个结构层次也就是最基本的结构单元硅氧四面体（SiO4）和铝氧四面体（ AlO4） ，它们构成分子筛的骨架。相邻的四面体由氧桥连结成环。环是分子筛结构的第二个层次，按成环的氧原子数划分，有四元氧环、五元氧环、六元氧环、八元氧环、十元氧环和十二元氧环等。环是分子筛的通道孔口，对通过
