1、PCR 技术及习题PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应1、PCR 原理：在解旋酶作用下，打开 DNA 双链，每条 DNA 单链作为母链，以 4 中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA 聚合酶从引物3端开始延伸 DNA 链，即 DNA 的合成方向是从子链的 5端自 3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内 DNA 的复制过程。DNA 的复制需要引物，其主要原因是 DNA 聚合酶只能从 3端延伸 DNA 链。2、PCR 反应过程是：变性复性延伸类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性- 退火（
2、复性） -延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：当温度上升到 90以上时，双链 DNA 解聚为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火（复性）：温度下降到 50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合；引物的延伸：72左右时，TaqDNA 聚合酶有最大活性，可使 DNA 新链由5端向 3端延伸。3、结果：上述三步反应完成后，一个 DNA 分子就变成了两个 DNA 分子，随着重复次数的增多，DNA 分子就以 2n 的形式增加。PCR 的反应过程都是在PCR 扩增仪中完成的。4、细胞被 DNA 复制与 PCR 技术的比较：细胞内 DNA 复制 体
3、外 DNA 扩增（PCR）解旋 在解旋酶作用下边解旋边复制80100高温解旋，双链完全分开酶 DNA 解旋酶、DNA 聚合酶 TaqDNA 聚合酶引物 RNA DNA、RNA不同点温度 体内温和条件 高温相同点需提供 DNA 模板四种脱氧核苷酸为原料子链延伸的方向都是从 5端到 3端知识点拨：1、DNA 分子复制的人工控制解开螺旋：在 80100时，DNA 双螺旋打开，形成两条 DNA 单链，称为变性。恢复螺旋：在 5060左右时，两条 DNA 单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液，DNA 模板、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶、两种引物。控制仪器：PCR 仪（温度周期性自
4、动调节仪） 。2、PCR 的含义是多聚酶链式反应。3、PCR 技术反应的条件：稳定的缓冲溶液环境（一般使用 Tris-Cl 缓冲液，标准的为 10mmol/L,并将其调节到 8.38.8 之间） ；DNA 模板；合成引物（2 个） ；四种脱氧核甘酸；DNA 聚合酶；温控设备4、PCR 技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。5、TaqDNA 聚合酶的特点是：耐高温。知识拓展：1、DNA 聚合酶不能够从头合成 DNA，只能从 DNA 的 3端开始延伸 DNA 链，因此 DNA 复制需要引物。2、引物: 引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的
5、程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。3、PCR 引物设计原则：（1）PCR 引物通常长 15-25 碱基，其中 GC 约占 50%。（2）引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。（3）引物的 3末端必须与目的片段完全相配。（4）引物的 5末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成习题训练1聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品 DNA 制备大量 DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品 DNA、DNA 聚合酶、
6、引物、足量的 4种脱氧核苷酸及 ATP 等。反应中新合成的 DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故 DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。（1）某个 DNA 样品有 1000 个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过 PCR 仪五次循环后，将产生 个 DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。（2）分别以不同生物的 DNA 样品为模板合成的各个新 DNA 之间存在差异，这些差异是 。（3）请指出 PCR 技术与转录过程的三个不同之处： 。 。 。2通过 DNA 重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一微量 DNA
7、样品DNA 互补链分离开为单链以单链为模板合成子代 DNA循环重复技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀” 能识别的序列和切点是一 G GATCC 一，请回答：（1）从羊染色体中“剪下 ”羊蛋白质基因的酶是 。人体蛋白质基因“插入 ”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是 。（2）请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。（3）人体蛋白质基因之所以能“插入” 到羊的染色体内，原因是 ， “插入” 时常用的工具是 。3下面甲图中 DNA 决定某一多肽链中的酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品 DNA 经 PCR 技术(聚合酶链式反应)扩增，可以获取大量 DNA 克隆分子。分析回答：（1）甲图中含有 种核苷酸；丙氨酸的遗传密码子是 。该图表示了 DNA 中遗传信息的 过程。（2）有一种贫血症是血红蛋白分子的一条多肽链上，一个酪氨酸被一个苯丙氨酸所替代造成的。此种贫血症的根本原因是 ，即 发生了改变。（3）乙图的“PCR” 与人体内的 DNA 复制相比有何特殊之处 ? 。（4）现在要通过“PCR”得到甲图中 DNA 片段的 1024 个克隆片段，则至少要向试管中加入 个腺嘌呤脱氧核苷酸。
