1、应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞沈怡 陈汉平 马庭元从孕妇外周血中分离胎儿细胞并进行遗传性疾病的检测，具有十分重要的临床价值。为了避免大量的母血细胞对胎儿细胞检测的干扰，必须对母血中的胎儿细胞进行分离富集。本研究采用流式细胞技术对 36 例孕妇外周血中的有核红细胞(NRBCs)进行分离纯化，初步探讨 NRBCs 在母血中的含量及与孕周的关系。一、资料与方法1.标本来源： 选择 1997 年 10 月至 1998 年 6 月在我院行产前检查的健康妊娠妇女 36 例(妊娠组)，年龄 2128 岁，孕周 1227 周，均为第 1 次妊娠，无严重贫血（血红蛋白90 g/L）等妊娠合并症或
2、并发症。对照组分别选择健康未孕妇女 10 例(未孕组)，年龄为 2125 岁，我院 1998 年 1 月至 6 月出生的新生儿 10 例(脐血组)。每次采血 5 ml。2. 实验方法：（1） 标本制备：抽取肘前静脉血，按常规方法分离，获得单个核细胞层。普通光学显微镜下计数细胞总数。（2）直接免疫荧光染色：按1105/l 比例加入异硫氰酸(FITC)标记的 CD71 单克隆抗体（华美生物公司产品，为鼠 IgM），孵育 30 min 后重悬于 0.5 ml 磷酸缓冲液中。（3）分选 CD71阳性细胞：FACSort 型流式细胞仪为美国 Becton-Dickson 公司产品。样品测试前，先用标准荧
3、光微球校准仪器。设定分选参数，将标记好的细胞用聚合甲醛固定后上机分选。（4）观察项目：收集分选细胞离心后，制成滴片直接置于荧光镜下。找到阳性细胞后，将玻片干燥再行 Wrights 染色，置于普通光学显微镜下观察其形态学特征。显微镜为日本产 Olympus 荧光显微镜。3.统计学处理：采用 t 检验。 二、结果1. CD71 阳性细胞分布：根据视窗中前向角散射（FSC）、侧向角散射(SSC)及细胞大小，细胞颗粒性可分为 3 个区域：低度 FSC,SSC 为红细胞，中度为淋巴细胞，高度为粒细胞。NRBCs 位于中度区域，荧光强度在 10210 3区域。2. NRBCs 的富集及染色情况：荧光镜下标
4、记上 CD71 单克隆抗体的细胞膜表面呈现绿色荧光，此类细胞为阳性细胞。将流式细胞仪分选后的细胞滴片，置于荧光显微镜下观察发现，妊娠组的阳性细胞极少，再将其涂片行瑞氏染色，发现细胞体积较淋巴细胞大，胞浆呈淡蓝色，胞核大而浓染，胞核与胞浆比约为 21。符合 NRBCs 的形态学特征。而脐血组阳性细胞丰富，膜表面荧光强，瑞氏染色符合 NRBCs 特征的细胞多。未孕组则未找到符合上述特点的细胞。3.CD71 阳性细胞表达情况：妊娠组妇女外周血中 CD71 阳性细胞的平均含量为(0.390.26)10 -2，未孕组妇女的 CD71 阳性细胞的平均含量为(0.070.04)10-2，而脐血组的 CD71
5、 阳性细胞平均含量高达(3.880.75)10-2。妊娠组与其他两组比较，差异均有极显著性(P0.01)。4.CD71 阳性细胞在外周血中的比例与孕周的关系：孕 12 周至 17 周，CD71阳性细胞的含量从 0.1110-2升至 0.6410-2，孕 19 周后逐渐降为 0.2210-2。三、 讨论1. 流式细胞仪分选 NRBCs:有研究表明，20 ml 母血中仅含 020 个胎儿细胞，用于产前诊断的唯一途径是对胎儿细胞进行富集 1 。近年来流式细胞仪分选功能的不断完善 2 。脐血的 CD71 阳性细胞含量最为丰富，这与脐血富含NRBCs 有关。而非孕妇女由于血中不含 NRBCs，其在荧光强
6、度 10210 3区域内的细胞数几乎为 0。妊娠妇女则介于二者之间。对阳性细胞较为集中的区域，进行分选获得的 CD71 阳性细胞含量较国外学者报道的 10-5的比例更高，达到了富集微量细胞的目的。Zheng 等 3 证实，流式细胞仪分选细胞的纯度和回收率均高于其他分选方法。2孕妇外周血中 NRBCs 的比例与孕周的关系: 明确胎儿细胞在孕妇外周血中出现的时间与孕龄的关系，是指导产前检查采血时机的关键。本研究发现，在孕早期外周血中 NRBCs 的含量随着孕周的增加而逐渐增加，孕 1719 周达高峰，以后随孕周的增加逐渐下降，与马旭等 4 的结果较为相似。 (本文编辑：潘伟)本课题受卫生部基金资助
7、（基金编号：96-2-112）沈怡（同济医科大学附属协和医院妇产科）陈汉平（430030 武汉，同济医科大学附属同济医院妇产科）马庭元（430030 武汉，同济医科大学附属同济医院妇产科）参考文献1，Simpson Jl. Isolating fetal nucleated red blood cells from maternal blood: the baylor experience-1995. Prenat Diagn, 1995, 15:907-912.2，左道富,主编. 流式细胞术与生物医学. 沈阳： 辽宁科学技术出版社, 1996. 19-22，80-81.3，Zheng YL, Demaria M, Zhen D, et al. Flow sorting of fetal erythroblasts using intracytoplasmic anti-fetal haemoglobin: preliminary observations on maternal samples. Prenat Diagn，1995, 15: 897-905.4，马旭,王毅,王琳,等. 经母血采集胎儿细胞行产前诊断的最佳时间探讨. 中华妇产科杂志, 1997, 32：293-295.
