1、中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件1预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指导原则等 9 个技术指导原则1.预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指导原则2.预防用 DNA 疫 苗临床前研究技术指 导原则3.艾滋病 疫苗临床 研究技术指导原则4.人用重组 DNA 制 品质量控制技术指导原则5.人用单克隆 抗体质 量控制技术指导原则6.人基因治疗研究和 制剂质量控制技术指导原则7.人体细胞治疗 研究和制剂质量控制 技术指导原则8.变态 反应原（变应原）制品 质量控制技术指导原则9.细胞培 养用牛血清生产和质量控 制技术指导原则返 回第 一页预防用以病毒为载
2、体的活疫苗制剂的技术指导原则一、前言以病毒为载体的预防用活疫苗是指将外源目的基因片段构建在病毒载体中，重组后的病毒载体导入机体后可表达目的蛋白，目的蛋白通过刺激机体产生特异性免疫学反应而达到预防某种疾病的目的。该指导原则适用于以病毒为载体的预防用活疫苗制品。其目的是为该类制剂提供一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定具体的申报内容。其基本原则是：安全有效，质量可控，同时应鼓励创新，促进以病毒为载体疫苗的研究。对一些新的技术路线要建立相应的质控要求，可有一定的灵活性，应注意到以病毒为载体活疫苗只是处于研究的初级阶段，而且与常规生物制品相比有其本身的特点，需要不断的积累经验。为此，申请者应
3、加强咨询和论证，提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终产品的制备，务必制订标准操作规程及质控标准，并予严格实施。二、疫苗构建的基本要求（一）国内外研究现状、立题依据和目的及预期效果1应了解所预防或治疗疾病的流行情况、疾病的危害程度等；包括国内及国外对该类疾病的预防和治疗手段。2应了解国内外同类产品研究和开发等情况，其中包括所用的 DNA 载体、目的基因片段、生产工艺、临床前试验和临床试验的结果及进展，以及该类产品所面临的主要问题。3对研制该类 DNA 制品用于预防疾病的有效性、安全性及必要性进行分析。4应对该方案与国外内已批准的或正在进行的
4、方案的不同之处、特点及其优越性等进行分析。凡属新的方案，应提供其优越性及安全性的依据。5利益风险比。根据该预防方案可能达到的效果及可能出现的副作用或危害，对总体的利弊权衡进行评价，并提出拟采取避免或减少其危害性或副作用的措施。这种评价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。（二）病毒载体及宿主细胞的有关内容1目前所用的病毒载体主要包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及痘苗病毒载体等。为此，应明确病毒载体的来源、结构，并进行必要的专利查询，其中包括载体 DNA 的限制性内切酶图谱。若有特殊的元件，如启动子、增强子以及 Poly A 位点等，应提供详细资料。若改变结构（如丢失片段或插入片
5、段） ，须对相应片段进行测序分析。若属新的或改变结构的病毒载体，须对组建的材料、方法、组建步骤及鉴定进行详细的研究。2生产用细胞：来源、传代历史以及质控的材料。包括细胞形态学、染色体组型、支原体、细菌、病毒等外源因子的检测结果。若需用其它辅助病毒，须明确来源、分离的方法步骤等。（三）目的基因中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件21明确目的基因来源的病原体及其它相关生物分子的基因序列及结构，并与我国主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析以及明确其血清型、基因型和亚型，对该种基因型或血清型的流行情况进行分析，若存在不同的血清型或基因型，应对所选择的血清型
6、或基因型与其它血清型或基因型交叉反应或交叉保护性进行分析和研究。2对目的基因的序列、大小、来源以及表达产物的预计大小进行分析；明确目的基因选择的依据以及其表达蛋白在防中的作用。3若对目的基因进行了修饰，应对其修饰后的基因序列以及修饰后基因与人类已知基因序列的同源性进行分析。若在表达的目的重组蛋白以外有其它氨基酸寡肽同时表达时，应对寡肽的作用和选择的依据进行分析。并对基因修饰或重组的利弊权衡进行分析。（四）重组病毒的构建及种子细胞库的建立1应对穿梭质粒与目的基因连接的详细步骤进行研究，并对构建以后的重组穿梭质粒进行检定和确证。对重组穿梭质粒的转化、扩增和纯化条件进行研究。2对目的基因片段导入病毒
7、的过程进行研究，建立切实可行的筛选和确证的方法。对含有目的基因片段的重组病毒的特征进行分析。3对重组病毒的特性进行检定，必要时进行序列分析，研究必要的控制元件和选择标记基因有无变异以及对插入的目的基因序列进行分析，检查有无变异。4应当对重组病毒感染细胞条件进行优化。对重组病毒的浓度、含量等进行分析。对重组的保存条件以及稳定性进行研究。应当建立重组病毒库。应对重组病毒库的外源因子进行分析。5产病毒的种子细胞库的组建：由病毒载体转染包装细胞或非包装细胞所组建的能复制并产生病毒的细胞系称为产病毒细胞系，即原始种子细胞库。该原始种子细胞库的组建过程必须予以详细说明，包括材料、方法、步骤、细胞系的鉴定。
8、其中应当包括细胞形态学、染色体组型、传代次数、稳定性、病毒滴度的检测、病毒介导目的基因的表达活性以及外源因子的检查等。6复制型病毒的检测：包括方法、技术可靠性及结果（五）对表达产物的分析1将重组病毒感染合适的哺乳动物细胞，对感染条件进行优化。2建立对表达产物的分析方法，包括表达产物的大小、特征等。3建立对表达产物的免疫学反应的特征进行分析的方法。三、生产工艺（一）工作细胞库的建立及质控：须明确工作细胞扩增的方法、传代次数、倍增时间、可允许的传代次数（保持同样的病毒滴度及转导基因的活性）及工作细胞库的规模、保存条件。并对以下内容进行研究：1细胞的均一性：包括细胞形态学、染色体组型、表型、导入基因
9、的存在状态及其表达。2病毒滴度3转导基因的活性4外源因子的检测结果5复制病毒的检测所有以上的项目在自检的基础上，均须由中国药品生物制品检定所检定或由国家药品监督管理局指定的单位检定。（二）种子细胞培养方法和扩增的步骤进行优化，建立培养过程中的质控指标。（三）对重组病毒的分离、富集及纯化的工艺进行优化，并建立相应的质控指标。（四）对原液的稀释分装的工艺进行优化，并建立质控指标。（五）添加物的质控：在细胞培养、制备过程中使用血清、生长因子、抗菌素等时，应对去除该类添加物的过程及效果进行研究。并应对保存液成份应进行安全性研究。四、制品的药理、毒理学研究（一）安全性试验1复制型病毒的检测，应严格检查复
10、制型病毒并制定相应的标准。中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件32特种添加物：除细胞培养及保存所用的试剂外，如使用明胶、缝线或金属粒子等其它添加物，应对此类物质进行动物安全性研究。3分子遗传学的评估：应对目的基因在体内的存在状态以及分布情况进行研究。4目前用于载体的病毒有疫苗株和非疫苗株，对非疫苗株应进行严格的安全性研究。（二）毒理反应的评估这也是安全性试验的重要组成部分。除目的基因可能导致的毒性外，导入系统的安全性评价至为重要，其安全性评估应包括急性毒性（最大耐受量）及长期毒性试验。毒性试验所用的剂量，除包括相当于临床使用剂量（按体重或表面积计算）外
11、，尚需有一个较大的剂量。给药途径应尽可能模拟临床给药或导入的形式。若改变途径须说明其原因及依据。毒性反应的观察，除常规检测项目外，应包括其它相关的检测指标。还应对局部刺激进行研究。（三）免疫学的评估应注意进入体内后的免疫反应有关的问题，包括过敏反应、排斥反应以及机体的自身免疫反应等。应对这些问题进行研究并提出相应的监控及处理措施。五、质量控制及检定的要求（一）生产过程中质量监控标准的建立及要求在生产工艺的各个环节和步骤中对其产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行。由于各申报者所选择的工艺不同，所制定的监控标准和在何步骤进行监控可能不同，但其原则是保证产品的质量、工艺的连续性和稳定性。（
12、二）产品的质量检定与要求1外观检查：根据样品的特征建立外观检查的质量标准。2p 值检测，可根据一般生物制品的要求建立标准,一般为 7205 。3鉴别实验，主要包括对病毒载体的鉴别和对表达产物的鉴别试验，对病毒载体的鉴别主要通过免疫学方法检测病毒蛋白、检测病毒核酸的大小或限制性内切酶对重组病毒的核酸进行酶切分析。对表达产物的分析主要用免疫反应检测基因表达产物和用 PCR 方法检测插入基因。4建立适当的方法对病毒的滴度及含量进行检测。5体外效力实验：检测其体外表达量，需建立定量检测表达抗原的方法以及表达抗原的定量标准，并对该检测方法的敏感性以及定量的准确性进行验证；还应检测表达抗原的图谱，其各表达
13、目的抗原的大小应与预计大小相同，应建立相应的方法并进行验证。制定各表达抗原的量和图谱的质量控制标准。6建立适当的方法检测复制型病毒，并制定相应的质控标准。7无菌实验：应检测需氧菌、厌氧菌以及支原体等，制品中应无该类微生物的污染。8热原试验：主要检测制品中有无热原物质，可用鲎试剂检测细菌的内毒素，并制定相应的质控标准。9异常毒性实验：主要用小鼠和豚鼠进行试验，一般小鼠腹腔接种一个人用剂量，豚鼠接种 5 个人用剂量。该试验是控制该类制品质量的重要指标，由于该制品与一般生物制品相比又有其特殊性，应根据病毒的特征建立不同的病毒特异性毒性反应，如可将以痘苗病毒为载体的制剂接种在兔背皮下观察肪性反应。10
14、属逆转录病毒的导入系统，应特别注意复制型病毒的检测。检测范围，包括前述种子细胞库、工作细胞库及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的 5%。细胞须用共培养法，产病毒细胞取样量须达到每批中 1%。检测方法，须用 S+/L-法、标记挽救法或 R/PCR 中的两种方法。必须用阳性对照（COS4070A 上清液）及阴性对照作严格定量标化，证明其敏感性及可靠性。PCR 应利用放射同位素杂交或同样敏感的系统。11若最终制品为腺病毒，须补充以下资料：（1）腺病毒颗粒数及感染单位的测定：目前公认的腺病毒的定量，是腺病毒颗粒测定，以腺病毒基因组 DNA 定量为依据，以 1 个 OD260 单位作为
15、111012 颗粒；同时要测定感染滴度。（2）复制型腺病毒的检测：参考美国 FDA1996 的建议，在一个病人用的腺病毒的总量中，复制病中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件4毒不超过 1 个 PFU。在整个制备过程中，从种子细胞库、工作细胞库的建立以及以后制备用于临床的病毒制剂，均需检测复制型腺病毒。检测必须有阳性对照，感染分子比率（MOI）在 10100 之间（过高MOI 可抑制复制型病毒的生长） 。12对残余宿主细胞的蛋白进行检测并建立质控标准。13生物效价：应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测
16、动物血清抗体的方法，并对该方法进行验证，可以计算小鼠 ED50 以及抗体产生的滴度，如有必要和可行，还应当建立评价抗体质量的方法，对抗体的质进行评价；在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的方法（如特异性 CL 反应的方法或 Elispot 方法等） ，也可通过对细胞因子的定量检测评价其细胞免疫情况，如属于常规检定项目，该类方法应稳定、重复性好、可操作性强，并制定相应的质量标准。若已有蛋白类疫苗，其评价方法应参照有关蛋白类疫苗的评价方法。若有动物模型，可进行动物保护性实验。14佐剂或呈递物质的质量评价：如在最终重组 DNA 制品含有佐剂或呈递物质，则应建立检测该类物质的量以及与重组 D
17、NA 结合率的方法，并制定质量标准。15添加物的质控：添加物指细胞培养、制备过程中所用的血清、生长因子等。应建立检测添加物的方法和质控标准。六、临床研究用样品要求（一）对申请 I 期临床试验的申报者，应在 GMP 条件下至少生产一批产品，其每批产量一般不少于 1000 人份。（二）产品必须由中国药品生物制品检定所进行质量复核。（三）完成每期临床研究后需及时总结材料并报国家药品监督管理局申请后续的临床试验。若效果明确，可以进行 III 期临床试验。申报者应当在 GMP 和正常规模化生产的条件下，并由中国药品生物制品检定所或国家药品管理局确定的药品检验机构进行质量复核。返回 第一页预防用 DNA
18、疫苗临床前研究技术指导原则一、前言DNA 疫苗是将外源目的基因片段构建在 DNA 质粒中，重组后的 DNA 导入机体后可表达目的蛋白，目的蛋白刺激机体产生特异性免疫学反应而达到预防某种疾病的生物制剂。该指导原适用于以 DNA 质粒为载体的预防用制品。其目的是为该类制剂提供一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定具体的申报内容。其基本原则是：安全有效，质量可控，同时应鼓励创新，促进 DNA 疫苗的研究。对一些新的技术路线要建立相应的质控要求，可有一定的灵活性，应注意到 DNA 疫苗只是处于研究的初级阶段，而且与常规生物制品相比有其本身的特点，需要不断的积累经验。为此，申请者应加强咨询和论证
19、，提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终产品的制备，务必制订标准操作规程及质控标准，并予严格实施。二、DNA 疫苗构建的基本要求（一）国内外研究现状、立题依据和目的及预期效果：1应了解所预防疾病的流行情况、疾病的危害程度等；包括国内及国外对该类疾病的预防和治疗手段。2应了解国内外同类产品研究和开发等情况，其中包括所用的 DNA 载体、目的基因片段、简单的生产工艺、临床前试验和临床试验的结果及进展，以及该类产品所面临的主要问题。3对研制该类 DNA 制品用于预防疾病的有效性、安全性及必要性进行分析。4应对该方案与国内外已批准的或正在进行的方案
20、的不同之处、特点及其优越性等进行分析。凡属新的方案，应提供其优越性及安全性的依据。中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件55利益风险比。根据该预防方案可能达到的效果及可能出现的副作用或危害，对总体的利弊权衡进行评价，并提出拟采取避免或减少其危害性或副作用的措施。这种评价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。（二）DNA 载体及宿主菌1测定 DNA 载体的全长核苷酸序列，以及与已知人类基因的同源性比较和分析。2对 DNA 载体的控制元件和选择标记的序列与来源，如：真核启动子、增强子、终止序列、抗生素抗性标记等进行分析。建议避免使用抗青霉素或其它 内酰胺抗菌
21、素的抗性标记，最好使用无抗性标记的 DNA 载体，若需要抗性标记，则可使用抗卡那霉素或新霉素的抗性标记。3对 DNA 载体的安全性进行研究和分析，尤其对病毒性启动子、哺乳动物细胞或病毒终止子的安全性进行研究分析。若使用非常用性或特殊的控制元件，应提供其安全性、对基因产物表达的影响以及其利弊权衡等进行分析。4明确宿主菌的基因型、原型、细菌的来源以及制备克隆菌群的方法步骤和所用实验材料。（三）目的基因1明确目的基因来源的病原体及其它相关生物分子的基因序列及结构，并与我国主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性进行分析以及明确其血清型、基因型和亚型，对该种基因型或血清型的流行情况进行分析，若存在不同的血清型
22、或基因型，应对所选择的血清型或基因型与其它血清型或基因型交叉反应或交叉保护性进行分析和研究。2对目的基因的序列、大小、来源以及表达产物的预计大小进行分析；明确目的基因选择的依据以及其表达蛋白在预防中的作用。3若对目的基因进行了修饰，应对其修饰后的基因序列以及修饰后基因与人类已知基因序列的同源性进行分析。若在表达的目的重组蛋白以外有其它氨基酸寡肽同时表达时，应对寡肽的作用和选择的依据进行分析。并对基因修饰或重组的利弊权衡进行分析。（四）重组质粒的构建过程1提供重组体质粒构建的详细步骤及每一步的鉴定及确证方法。2重组质粒库：构建完成后应建立重组质粒库，对重组质粒应进行全基因序列分析，尤其对 DNA
23、载体的控制元件和选择标记基因有无变异进行分析。对插入的目的基因序列进行分析，检查有无变异。3应当对重组质粒的转化、扩增及纯化条件进行优化。对重组质粒库中质粒的浓度、含量等进行分析。对重组质粒的保存条件以及稳定性进行研究。（五）表达产物的鉴定1将重组质粒转化合适的哺乳动物细胞，对转化条件进行优化。2建立对表达产物的分析方法，包括表达产物的大小、特征等。3建立对表达产物的免疫学反应的特征进行分析的方法。三、DNA 疫苗的生产工艺（一）建立菌种库：对转化大肠杆菌的条件进行优化。建立原始种子库。对种子库的遗传稳定性进行分析，要明确该种子库可以传代的次数。在此基础上建立主细胞库和工作细胞库，并应保证该类
24、细胞库无噬菌体和其它外源因子的污染；并对细菌的遗传背景进行分析和检测，保证细胞库中细菌的遗传背景包括染色体组型、表型未发生改变；应检测细菌的形态学，保证细菌的均一性；应检测导入基因的存在状态。并对工作细胞库的规模、保存条件、扩增条件、传代过程中质粒的稳定性（拷贝数及表达量） 、允许的传代次数等进行研究。（二）对工作细胞库扩增的条件进行优化，并制定相应的质控指标。（三）应对 DNA 制备与纯化工艺中各种条件进行优化，建立稳定的纯化工艺，并制定相应的质控指标，而且为进行临床试验，应建立符合 GMP 要求的生产的环境。（四）对佐剂或呈递物质的要求如果在重组 DNA 终制品中使用佐剂或呈递物质，则对以
25、下问题进行研究或提供相关材料:1对于已经明确有佐剂效应或者已经商品化的佐剂和呈递物质，只需提供该类制剂的组分或化学中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件6组成，国内外使用该类制剂的情况，无需再进行毒理和安全性研究。若国内外均未使用过该类佐剂,则必须对其作用原理、安全性及佐剂效应进行详细的研究并建立切实可行的评价方法。2对该类制剂的制备工艺进行优化，若使用脂质体或多肽类物质时，由于脂质体的形成及多肽类合成过程的随机性，不可能达到一般化学合成物的均一性及纯度，为此应对不同批号间保证安全有效的可以达到的最大均一性的程度进行研究，并制定可以接受的质量标准。3若该
26、类制剂需与重组 DNA 制品结合，则应对结合工艺进行优化，建立检测结合率、结合均一性的方法，并制定结合标准。（五）若与调节免疫反应的因子等同时表达，则应对这类分子进行详细的分析，包括因子的大小、表达量及免疫学反应等。若这种因子未批准上市，则应对这类分子进行单独的药理和毒理学研究。四、药理、毒理和生物分布该类制品不同于一般的化学药品，药理、毒理和药代动力学的实验要求具有特殊性，因此，该制品的药理学实验主要包括发生作用的原理、生物效价与剂量的关系、免疫程序和接种途径与效果的关系等；在毒理学方面主要考虑接种部位的病理反应、机体产生的抗核酸抗体反应、基因整合和必要时的致瘤性分析等；药代动力学主要包括重
27、组 DNA 的分布、持续时间等。申报时应完成药理、毒理和药代动力学的研究，并提供实验资料。由于以上各方面是互相关联的，因此，将药理、毒理和药代动力学有关内容联系在一起进行描述。（一）免疫原性或生物效价的评价应建立适当的实验及检测方法来评价该类制品的免疫原性或生物效价，如果有动物模型或可建立动物模型，可以采用动物模型直接评价该类制剂的生物效价，如：对一些有动物模型的感染性疾病，可以采用病毒的攻击实验来评价该类制剂的保护效果。而且要建立剂量与生物效价的关系，通过实验优化免疫程序和接种途径。（二）持久性、耐受性以及生物分布的评价由于抗原在机体内长期表达可能诱发机体的免疫耐受或产生自身免疫反应，应对抗
28、原在机体中的表达持续时间进行动力学分析。由于重组 DNA 接种到人体以后，机体可能诱发产生抗核酸的抗体，应建立检测抗核酸抗体的检测方法，并对机体产生该类抗体的情况进行分析。如果整合到人体基因，可能造成人体基因的断列或重排而诱发染色体的不稳定性，从而可能产生遗传毒性或致瘤反应，因此，在临床前研究中应对基因整合的可能性进行分析，最好在猴体内进行实验，建立检测基因整合的方法，对重组 DNA 在接种部位组织及其它组织、器官的分布进行检测分析；对重组 DNA 在分布的组织和器官中持续时间进行追踪检测分析；在分布的组织及器官中是否发生整合进行检测；在该类研究中尤其注意重组 DNA 制品在生殖腺中是否有分布
29、和整合。如果实验证明重组 DNA 分布于大部分组织或器官，而且有足够的证据证明是否发生整合作用，或者该类制品将长期用于控制或预防非致命性疾病时，应对该类制品的致瘤性进行研究。尤其在重组 DNA中有与人基因同源性很高的序列或有已知的潜在的致瘤性基因序列时，更应进行致瘤性分析，应建立检测方法，可以采用细胞或裸鼠的方法。五、质量控制及检定的要求（一）生产过程中质量监控标准的建立及要求在生产工艺的各个环节和步骤中对其产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行。由于各申报者所选择的工艺不同，所制定的监控标准和在何步骤进行监控可能不同，但其原则是保证产品的质量、工艺的连续性和稳定性。（二）产品的质量检
30、定与要求1外观检查，根据样品的特征建立外观的质量标准。2p 值检测，可根据一般生物制品的要求建立标准,一般为 7205 。3DNA 含量的检测，应建立检测含量的方法，其实测值应与制品的标示量相符。4纯度，主要是评价纯化的重组 DNA 制品中是否含有宿主 RNA、DNA 和蛋白的污染。一般采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测制品中有无 RNA，要求无明显的 RNA 带型；一般采用中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件7Northernblot 的方法检测制品中残留的宿主 DNA 的含量，在该方法的研究时应建立宿主 DNA 的标准品，并对该类试剂的敏感性和特异性进行
31、验证。要求 DNA 制品中残余的宿主 DNA 含量不超过 0002ug/ug ，每个人用剂量不超过 5mg。可以采用酶联免疫法（ELISA）或氨基酸分析法检测制品中宿主蛋白的残余量，在该方法的研究过程中应建立宿主蛋白的定量标准，并对检测方法的敏感性和特异性进行验证，其性能能满足该实验的要求。宿主蛋白的含量应不超过 0001ug/ug ，每个人用剂量不超过 5ug。可以检测样品在波长为 260nm 和 280nm 的紫外吸收值，并计算 A260/A280 的比值，评价制品的总体纯度，要求其比值在 175 以上。5质粒大小的均一性和结构的分析：主要是分析超螺旋结构与线性和松弛性质粒的比例，一般采用
32、琼脂糖凝胶电泳的方法对制品进行电泳分析，并用扫描仪对电泳结果进行扫描，分析各带型所占的比例，一般要求环状结构的重组质粒所占的比例在 90%以上。6鉴别实验：主要是对重组质粒的特征以及是否含有正确的插入片段进行分析。至少用三对以上限制性内切酶对重组质粒进行酶切，对酶切产物分别进行电泳分析，观察是否有特征性的带型；用 PCR方法对插入片段进行扩增或用特征性的酶切方法分析插入的基因片段的大小是否与预计的大小一致。7体外效力实验：体外转染哺乳动物细胞，检测其表达量，需建立定量检测表达抗原的方法以及表达抗原的定量标准，并对该检测方法的敏感性以及定量的准确性进行验证；还应检测表达抗原的图谱，其各表达目的抗
33、原的大小应与预计大小相同，应建立相应的方法并进行验证。制定各表达抗原的量和图谱的质量控制标准。8无菌实验：应检测需氧菌、厌氧菌以及支原体等，制品中应无该类微生物的污染。9热原实验：主要检测制品中有无热原物质，可用鲎试剂检测细菌的内毒素，要求内毒素的含量不高于 001EU/ug ；每个人用剂量不超过 20EU，也可以用其它方法检测制品的热源。10抗生素及其它添加物质残余量的检测由于 DNA 载体一般使用抗菌素的选择性标记，重组 DNA 的研制和制备过程中采用含抗菌素的选择性培养基进行培养，在纯化制品中对抗菌素的含量应进行限制，因此，应建立检测抗菌素的检测方法并制定抗生素残留量的要求。在重组 DN
34、A 的培养和纯化工艺中，可能需要一些其它物质或基质，如纯化工艺中可能需要乙醇，这些物质可能对人体有潜在的危害，应在纯化制品中限制其含量，因此，应建立检测方法并制定残留量的标准。11安全性实验：该实验是控制该类制品质量的重要指标，由于该制品的与一般生物制品相比又有其特殊性，因此，在安全性方面除了考虑一般的安全性实验，还应考虑该制品的特异性安全性。一般性安全实验：主要用小鼠和豚鼠进行实验，一般小鼠腹腔接种一个人用剂量，豚鼠接种 5 个人用剂量。12稳定性实验：由于 DNA 超螺旋结构的不稳定性，而且超螺旋结构的比例多少可能影响重组 DNA的转染率，因此，在该类制品的稳定性实验中应主要考虑超螺旋结构
35、的稳定性。应建立检测超螺旋质粒稳定性的实验方法，并建立相应的质量标准。13生物效价：由于用于预防的 DNA 制剂所发生作用的原理不同，评价其生物效价的方法也不同。如果 DNA 制剂是通过免疫反应发生作用的，则应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测动物血清抗体的诊断试剂，并对该类试剂进行验证，可以计算小鼠 ED50 以及抗体产生的滴度，如有必要和可行，还应当建立评价抗体质量的方法，对抗体的质进行评价；在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的方法（如特异性 CL 反应的方法或 Elispot 方法等） ，也可通过对细胞因子的定量检测评价其
36、细胞免疫情况，如属于常规检定项目，该类方法应稳定、重复性好、可操作性强，并制定相应的质量标准。若已有蛋白类疫苗，其评价方法应参照有关蛋白类疫苗的评价方法。若有动物模型，可进行动物保护性实验。14佐剂或呈递物质的质量评价：如在最终重组 DNA 制品含有佐剂或呈递物质，则应建立检测该中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件8类物质的量以及与重组 DNA 结合率的方法，并制定质量标准。六、临床研究用样品要求（一）对申请 I 期临床试验的申报者，应在 GMP 条件下至少生产一批产品，其每批产量一般不少于 1000 人份。（二）产品必须由中国药品生物制品检定所进行质
37、量复核。（三）完成每期临床研究后需及时总结材料并报国家药品监督管理局申请后续的临床试验。若效果明确，可以进行 III 期临床试验。申报者应当在 GMP 和正常规模化生产的条件下生产，并由中检所进行质量复核。返回第 一页艾滋病疫苗临床研究技术指导原则一、前言艾滋病的流行对人类健康和社会发展产生了严重危害，迫切需要采取有效的预防和控制措施。艾滋病疫苗是控制艾滋病的重要手段。对 HIV 致病机理的研究证实有时人体能够取得对 HIV 的自然免疫，发展安全有效的艾滋病疫苗在理论上是可行的。艾滋病疫苗研究的目标是发展一种能够预防 HIV 感染的方法。但是艾滋病免疫保护的机理十分复杂，很难完全预防 HIV
38、感染并清除病毒，因此正确认识和评价疫苗的作用是十分重要的。能够限制病毒的复制、减少 HIV 传播的艾滋病疫苗对于控制艾滋病的流行也是有效的。更现实的艾滋病疫苗的研究目标是降低病毒血症、保持低病毒载量水平、减缓 HIV 疾病的进程，降低病毒在人群中的传播率。临床试验是确定疫苗安全性和有效性的决定性方法，艾滋病疫苗必须通过科学设计的三个阶段临床试验的检验，考察其安全性、以及能否达到预期的目标。为了确保艾滋病疫苗临床研究的准确性，必须有科学、周密的设计和严格的管理。二、艾滋病疫苗临床试验的基本原则（一）符合赫尔辛基宣言的伦理学准则，研究对象的权利、安全和意志高于研究的需要。（二）为研究对象保密，尊重
39、个人隐私。防止研究对象因接种艾滋病疫苗而受到歧视。（三）临床前研究的结果支持进行临床研究。（四）符合 GCP 要求。三、艾滋病疫苗临床试验的方法和步骤（一）临床试验的前提和条件1具备相关的实验室技术和条件，建立和完善检测 HIV 感染和免疫学指标的方法，建立区分疫苗诱导的抗体与野病毒感染产生的抗体的方法。2掌握多中心研究的现场，具有 HIV 感染高危人群队列研究的基础。3具有适合进行临床试验的疫苗：试验用疫苗和安慰剂必须是适合进行临床研究的产品，在 GMP条件下生产，通过国家检定。疫苗和安慰剂的外观应完全相同。（二）研究对象的招募和筛选1研究对象期试验招募 HIV 阴性的健康志愿者。/期试验招
40、募 HIV 阴性的高危人群，包括 HIV 感染者的性伴或静注毒品者。也可以招募和随机分配整个 HIV 感染高危险性社区人群。男性或女性均可，年龄18-60 岁。2知情同意是一个精神健全的个体在获取必要的信息后，做出的是否参与研究的决定。研究对象要能够充分理解项目内容，并在没有受到强迫和诱导的情况下自愿做出决定。研究者在项目开始前要向研究对象充分讲解项目的内容，在研究进行的过程中也要不断向研究对象介绍研究进展情况、出现的问题和解决的办法。要用研究对象熟悉和易懂的语言解释研究的目的、方法、步骤和可能出现的危害，请他们中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件9自
41、愿决定是否参加研究，并申明在研究的过程中他们随时可以退出，无任何不良影响。要向研究对象提供一份知情同意文件，请他们自己决定是否签署文件。3体格检查首先进行健康问卷调查，请研究对象提供详细的病史，包括性活动和药物使用史。然后进行体检，包括血、尿常规检查、胸部 X 线检查。女性需进行妊娠实验，阴性才能参加研究。所有研究对象自研究开始直至免疫结束后的 3 个月内性交时必须使用屏障方法避孕。4行为咨询对研究对象进行规范的 HIV 感染的危险性评估和行为咨询，防止由于接种疫苗导致危险行为增加。（三）期试验*目的：检验疫苗的安全性、检验机体是否有免疫应答。*实验人数：20-30 名 HIV 阴性的健康志愿
42、者。*方法：第一次接种和每次加强接种均需将研究对象收入艾滋病疫苗临床基地医院中观察，直至接种以后3 天。为所有研究对象接种试验疫苗，按照预定的接种程序从最小剂量起，在上一次接种没有明显毒副反应时再进行下一次接种。*观察时间：最后一次接种完成后 6 个月。*观察指标：1毒副反应：自接种之日起至接种完成以后 28 天，请研究对象每天填写健康记录卡，有不良反应随时与研究人员联系。接种后第 7 天、14 天、28 天进行体检，以后每月体检一次。体检项目包括血、尿常规检查和胸部 X 线检查。2HIV 感染的指标：HIV 抗体测定，用已经建立的检测疫苗诱导的抗体和野病毒感染产生的抗体的方法进行血清学检测，
43、区分接种疫苗与野病毒感染，必要时进行 HIV RNA 测定。3免疫应答：HIV 保护性抗体测定（中和抗体或粘膜 IgA） 、HIV 特异性细胞免疫测定。（四）期试验（第一阶段）*目的：在 I 期试验的基础上进一步检查疫苗的安全性，观察疫苗能否刺激机体特异性免疫应答，评估疫苗的安全性和生物活性，确定理想的接种剂量和程序。*实验人数：300 名以上 HIV 阴性的高危人群。方法：按照预定的接种剂量和接种程序将研究对象分组，为他们接种疫苗。在上一次接种没有明显毒副反应时再进行下一次接种。*观察时间：最后一次接种以后 1 年。*观察指标：1毒副反应：自接种之日起至接种完成以后 28 天，请研究对象每天
44、填写健康记录卡，有不良反应随时与研究人员联系。接种后第 7 天、14 天、28 天进行体检，以后每月体检一次。体检项目包括血、尿常规检查和胸部 X 线检查。2HIV 感染的指标：HIV 抗体测定，用已经建立的检测疫苗诱导的抗体和野病毒感染产生的抗体的方法进行血清学检测，区分接种疫苗与野病毒感染，必要时进行 HIV RNA 测定。3免疫应答：HIV 保护性抗体测定（中和抗体或粘膜 IgA） 、HIV 特异性细胞免疫测定。（五）期试验（第二阶段）*目的：在第一阶段试验的基础上进一步检验疫苗的安全性和特异性免疫应答，初步考察有效性。确定理想的接种剂量和程序。*实验人数：200 名 HIV 阴性的高危
45、人群。*方法：随机、双盲对照。两组的人数应该相等或接近。按照预定的接种剂量和程序，在上一次接种没有明显毒副反应时再进行下一次接种。*观察时间：最后一次疫苗接种以后 2 年。中国食品药品化妆品法规网（www.fdc-） 国药监注2003109 号的附件10*观察指标：1毒副反应：自接种之日起至接种完成以后 28 天，请研究对象每天填写健康记录卡，有不良反应随时与研究人员联系。接种后第 7 天、14 天、28 天进行体检，以后每月体检一次。体检项目包括血、尿常规检查和胸部 X 线检查。2HIV 感染的指标：HIV 抗体测定，用已经建立的检测疫苗诱导的抗体和野病毒感染产生的抗体的方法进行血清学检测，
46、区分接种疫苗与野病毒感染，必要时进行 HIV RNA 测定。3免疫应答：HIV 保护性抗体测定（中和抗体或粘膜 IgA） 、HIV 特异性细胞免疫测定。4HIV 感染者病毒载量和 CD4+细胞计数测定。5HIV 感染危险行为的监测。6HIV 感染者的性伴和新生儿 HIV 感染的监测。（六）期试验*目的：确定疫苗的安全性和有效性。*实验人数：3000 名以上 HIV 阴性的高危人群。样本大小取决于发病率、估计的疫苗有效率和统计学显著性。*方法：随机、双盲对照。两组的人数应该相等或接近。用根据/期试验得出的免疫方案进行接种。*观察时间：最后一次疫苗接种后至少 3 年。*观察和监测指标：1毒副反应：
47、接种后 28 天内请研究对象每天填写健康记录卡，以后每周填写一次，有不良反应随时与研究人员联系。每 6 个月进行一次体检，进行血、尿常规检查和胸部 X 线检查。2HIV 感染的指标：HIV 抗体测定，用已经建立的检测疫苗诱导的抗体和野病毒感染产生的抗体的方法进行血清学检测，区分接种疫苗与野病毒感染，必要时进行 HIV RNA 测定。3免疫效果：HIV 保护性抗体测定（中和抗体或粘膜 IgA） 、HIV 特异性细胞免疫测定。4HIV 感染者病毒载量和 CD4+细胞计数测定。5HIV 感染危险行为的监测。6HIV 感染者的性伴和新生儿 HIV 感染的监测。*统计学有效水平：证实疫苗减少了 HIV
48、感染的水平至少要达到 30%统计学显著性，也就是如果临床试验被重复，应该在 100 次试验中有 95 次观察到 30%以上的效果。为了达到具有统计学意义的 30%有效性，必须观察到接种疫苗组与对照组相比，感染率下降 45-65%或更高，取决于影响临床试验统计学显著性的一些因素，包括纳入的志愿者的数量、对照组的感染率、临床试验观察的时间等等。四、艾滋病疫苗临床试验的替代终点对于多数传染病来说，有效的疫苗应能够预防疾病的发生、并使宿主清除感染性病原体。艾滋病是一种持续性感染而不是急性自限性疾病，临床终点如果是证实没有疾病就需要观察很多年（10-20 年）。有必要建立和使用替代终点指标以加快疫苗效果
49、的验证，以便能够用最快捷的方法评估候选疫苗的有效性,艾滋病疫苗临床试验短期内可能观察到以下三种结果：接种疫苗组的 HIV 感染率显著下降、接种疫苗组的 HIV 感染率没有显著下降，但是接种后感染者的疾病进程显著减缓、接种疫苗组的 HIV 感染率和感染者的疾病进程与对照组相比均没有显著变化。尽管预防 HIV 感染是最希望看到的结果，但是有些疫苗可能仅仅对减缓 HIV 疾病的进程或减少 HIV 的传播有好处。因此可以在评估 HIV 疾病进程的基础上建立替代终点指标。（一）病毒学终点1降低病毒载量的定点（set point）大于 1 个 logRNAcopies/ml。2降低血浆病毒载量到有生物学意义的定点以下（103RNAcp/ml） ，同时延长作用有意义的时间（大于 1 年） 。（二）免疫学终
