1、,第六章 动物人工繁殖,本章主要内容： 1、核移植动物（克隆动物） 2、体外受精动物（试管动物）,本章关键问题： 1、核移植动物的培育：核移植、重组胚的激活 2、体外受精动物的培育:精子获能与卵细胞成熟培养、体外受精方法、性别控制的原理与方法,一、细胞核移植(cell nuclear transfer)将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。 细胞核移植动物：用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到扩繁种群的目的。,第一节 细胞核移植定义及发展历程,核质杂
2、种,理论基础：生物的主要遗传物质存在于细胞核中，因此克隆动物可以通过细胞核移植实现。 克隆（Clone）本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一生物个体的无性繁殖群体。 细胞工程的克隆是指通过无性繁殖手段获得遗传背景相同的细胞群或个体的技术。,包括基因水平、细胞水平、胚胎水平、个体水平上的复制。,以供体核的来源不同可分为胚胎细胞核移植与体细胞核移植两种。,分 类,细胞分化程度低， 恢复全能性容易,细胞分化程度高， 恢复全能性不容易,二、细胞核移植动物的发展历程 1、两栖类（20世纪50年代） 2、鱼类（20世纪60年代） 3、哺乳类（20世纪80年代）,1、两栖类时期 两栖类动物卵数量较多
3、且容易获得，体积较大，操作方便，成为早期动物细胞核移植研究的材料。 1952年，美国科学家布里格斯（Briggs）和托马斯金（T.J.King）将豹蛙进行胚胎细胞核移植，获得了一个无性繁殖的豹蛙幼体。,2、鱼类时期1980年，中国将鲫鱼胚胎细胞移入鲤鱼去核的未受精卵中实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。表现出部分父母的性状，在生长优势、蛋白质含量上超过双亲。,3、哺乳动物类时期1984年，丹麦科学家斯丁维拉德森成功利用胚胎细胞克隆出一只绵羊，这是首次证实的通过核移植技术克隆哺乳动物，证明胚胎细胞具有全能性。,里程碑式的突破 1997年，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL
4、制药公司利用高度分化的绵羊乳腺上皮细胞，通过核移植克隆了一只雌性小绵羊多莉。这是第一个体细胞克隆动物。,成熟的体细胞也具有全能性,我国首例“胎儿皮肤上皮细胞”克隆牛“康康”,克隆牛“欣欣”，生命源于耳细胞,供体核的获得,第二节 细胞核移植克隆动物的技术路线,一、核移植技术的操作程序 供体核的获得 受体细胞的获得及其去核 细胞核移植 重组胚激活 重组胚培养和移植 体细胞核移植后代的鉴定,（一）供体核的获得供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行15 天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态。通常采用处于G0期细胞作为核移植的供体细胞。
5、诱导细胞脱离正常周期而进入G0期。,胚胎细胞、胚胎干细胞、体细胞,采用细胞松弛素B（Cytochalasin B）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。,（二）受体细胞去核 1、盲吸去核法：用微细玻璃管吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率 2、功能性去核法：使用Hoechst33342与卵细胞DNA结合后，用紫外线定点照射使核功能丧失。,减数分裂期成熟卵母细胞,（三）细胞核移植 细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法。 前者是用微吸管吸取供体核后，直接刺破受体卵质膜，将核
6、直接注入卵周隙，完成细胞核移植。 后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中，使供体细胞与卵质膜接触，融合处理使供体核进入受体卵胞质内，形成重组胚。,对卵膜及卵细胞质损伤大，造成卵母细胞死亡,（四）重组胚激活正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制，成熟的卵母细胞质能使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化，从而使供体核的基因从头开始进行顺序表达。,重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法。 1、电激活：是可把重组胚放在电融合槽两极之间，用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活。 2、化学激活：常用的激活剂包括乙醇、放线菌酮、离子霉素等。,（五）重组胚培养和移植
7、 激活后的重组胚可以采用体内和体外两种培养方式。 1、体内培养：将重组胚植入同种或异种动物的输卵管中发育至囊胚或桑椹胚，然后进行胚胎移植。 2、体外培养：将重组胚在特定培养液中培养至囊胚，选择优质胚胎移入同种的同期发情的受体中继续发育。,（六）体细胞核移植后代的鉴定 对于体细胞核移植培育的动物，可以从形态、性别上鉴定，还可以采用分子生物学技术鉴定。,二、胚胎细胞核移植克隆动物哺乳动物的胚胎细胞具有全能性，理论上每个胚胎细胞经过核移植，都能发育成遗传性状完全相同的个体。将胚胎细胞分离，体外培养获得胚胎干细胞系，再经过胚胎干细胞核移植可培育更多的动物个体。,选用了三种不同品系小鼠作为核供体、核受体
8、和养母，最后得到了具有核供体特征的克隆小鼠。,三、体细胞核移植克隆动物将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，培育成早期胚胎，将胚胎移植至受体，妊娠产仔培育出与核供体一样的成体动物的一种细胞工程技术。理论价值：高度分化的体细胞具有全能性。,实践意义： 1、由于体细胞数量丰富并且易于获得，因此体细胞克隆动物技术在加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物（如大熊猫），保护生态平衡方面意义重大。,2、可以用患者本人细 胞培育出新组织，消除免疫排斥反应。,（一）供核细胞获得与取核取一只6岁已妊娠到后期的白色的芬兰多特西母羊的乳腺组织，酶消化分解成单个细胞，将这些细胞转移
9、到缺乏营养的培养基上培养传代，其培养基的胎牛血清浓度从10%下降至0.5%，这样使细胞停在休止期（G0期） 。在倒置显微镜下，用显微吸管将核吸出。,（二）卵母细胞收集与去核 1、受体卵细胞来自于苏格兰黑绵羊，在注射促性腺释放素(GnRH)28-33h时，收集卵细胞。 2、在倒置显微镜的视野下用显微吸管刺入，吸取中期染色体和少量细胞质。 3、去核后卵细胞放在无钙镁，含有1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液中复原，然后转移到37、无钙、但含有10%的胎牛血清的M2培养液中保存备用。,（三）细胞核融入卵细胞将核和已去核的卵细胞放入同一培养皿中，在交变脉冲电压为3V的电场中融合5min，再用1.25 kV/cm
10、 80s直流电脉冲3次，将乳腺细胞核融入卵中形成一个含有新遗传物质的卵细胞称之为重构胚。,（四）重构胚的培养将重构胚种植在绵羊结扎的输卵管中培养，大约培养6天后，大多数胚胎发育到桑椹期或囊胚期。再选择发育优良的重构胚移植到苏格兰黑绵羊的子宫中，每只受体母羊移植13个重构胚。,（五）妊娠监护 1、妊娠60天时用超声波诊断妊娠。 2、每两周进行一次全方位监护胎儿发育。 3、分娩时由兽医外科医生助产。 4、产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。,从理论上讲，多莉继承了提供体细胞的那只绵羊的遗传特征，它是一只白脸羊，而不是黑脸羊。分子生物学的测定也表明，它与提供细胞核的那头羊，有完全相同的遗传物质，
11、它们就像是一对隔了6年的双胞胎。 多利没有父亲，它是通过无性繁殖或者说克隆而来。,四、细胞核移植技术的应用 1、 畜牧业生产方面：利用体细胞克隆技术可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。 2、 保护濒危物种方面：挽救濒危物种，保护生态平衡。,3、 在医药方面： 利用转基因克隆动物生产珍贵的医用蛋白。利用转基因技术将药物蛋白基因转移到动物中并使之在乳腺中表达，产生含有药物蛋白的乳汁，并利用克隆技术繁殖这种转基因动物，大量制造药物蛋白。, 利用转基因克隆动物细胞、组织器官作为异种移植的供体，治疗疾病。先把人体相关基因转移到纯系猪中，再用克隆技术把带有人类基因的特种猪大量繁殖产生大量适用器官，
12、当猪的器官植入病人体内时，免疫排异反应减弱，成功率提高。, 利用人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官，用于组织器官的移植。,4、在科研领域方面： 研究克隆动物和克隆细胞，从而更深入地了解胚胎发育及衰老过程； 利用克隆动物做疾病模型，使人们更好的追踪研究疾病的发展过程，从而治疗疾病。,主要问题： 1、如果将克隆高产奶牛的任务交给你，你将如何对它进行克隆？ 2、体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。 推荐文献： 1、牛华峰，张振仓，张君慧。动物胚胎工程技术研究进展。畜牧兽医杂志，2005，24（6）：24-26。 2、韩堃，刘东军。细胞核
13、移植技术的发展及其应用。中国生物制品学杂志，2007，20（6）：467-470。,第三节 体外受精动物,一、定义体外受精( In vitro fertilization，IVF ) 是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。体外受精动物也称试管动物（test tube animal），是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。,世界上首批试管动物,1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h 的母兔子宫中冲取精子( 即体内获能的精子) ，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外
14、人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6 只受体的输卵管中，其中4 只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。,二、优点 （1）发挥优良母畜的繁殖潜力：一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育，最后一个卵泡成熟并排卵。一只良种母畜一生大约只能繁殖10个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。试管动物繁殖技术能够充分利用母体生殖潜力。 （2）促进家畜改良的速度：繁殖能力的提高促进家畜改良速度，加速育种过程。 （3）保存遗传资源：对优良或稀有哺乳动物建立“胚胎库”，进行受精卵或胚胎
15、的长期保存。,例如：“世界山羊之王” 波尔山羊体格高大，四肢粗壮，身体丰满。平均日增重350 克，屠宰出肉率可达60%以上。具有适应性强、采食性广、繁殖性能好、肉用性十分显著等特点。,知识回顾,受精1天后才开始卵裂。 8细胞之前，分裂球之间结合比较松散。 接着形成致密的球体16细胞期，内部1-2个细胞属于内细胞团，将来发育为胚胎，而其外周细胞变为滋养细胞。 动物的胚胎在64细胞以前为实心体，称为桑椹胚。 继续分裂成由100多个细胞组成的早期胚泡。细胞团内部空隙扩大，成为充满液体的囊胚腔，此时的胚胎称为囊胚。囊胚的大小仍和受精卵相似，但细胞已经增殖到上千个。,三、试管动物培育流程 （1 ）精子采
16、集与体外获能、卵子采集与成熟培养 （2 ）体外受精 （3 ）胚胎体外培养 （4 ）胚胎移植(Embryo transfer，ET)：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术。 （5 ）体内发育、出生,1、精子的采集与体外获能处理,采集：精子上游法采集，在精液上面加入少量培养液，有活力的精子游到表面，收集。 精子获能(Capacitation)是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。 精子的顶起反应：遇到卵子时，精子头部“顶体” 脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞，达到受精的目的。,体内获能,雄性精液中含有“去
17、能因子”（多是糖蛋白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。 去能因子的清除，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力。 主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的淀粉酶、胰蛋白酶、葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高。可以水解糖蛋白等“去能因子”。,体外获能,精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能，最后用化学成分明确的溶液培养获能。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。1986年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。,2、卵子的回收与成
18、熟培养,(1) 超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处 理后，从输卵管中冲取成熟卵子，可直接与获能精子受精。 (2) 从活体卵巢中采集卵母细胞：借助超声波探测仪内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。,卵母细胞体外成熟培养,未成熟卵母细胞（初级卵母细胞、次级卵母细胞）要经过成熟培养使卵细胞成熟。 家畜卵母细胞成熟培养液普遍采用TCM199 培养基添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。血清是大分子营养物质的主要来源，而且可提供细胞生长因子。作为能量来源的物质主要是葡萄糖，氨基酸也可作为能源起作用。 卵母细胞的体外培养还需对温度、渗透压、pH、 气相等进行控制。,卵母细胞体外培
19、养：通常采用微滴培养法，微滴体积一般为50-200 微升，每个微滴中一般放入10-40 个卵母细胞。二氧化碳培养箱培养，条件为39，100% 湿度，5%二氧化碳。 成熟标志：极体排出、透明带软化、卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特异性染料染色后，在显微镜下进行核相观察可见卵母细胞处于第2 次成熟分裂中期。,3、试管动物的体外受精,精子发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。 顶体酶就是通过这些小孔释放出去，使卵细胞周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解透明带。 精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原 核和雌性原
20、核合二为一，完成受精过程。,共同培养：一般将成熟的卵母细胞和获能的精子在一个合适的体外环境条件下共同培养一段时间，就能完成体外受精。 受精过程所采用的培养液与动物细胞培养用培养液类似，但需添加一些特殊物质，如肾上腺素、亚牛黄酸、肝素等，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。 精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密度为1-9106/ml，每10微升精液中放人1-2枚卵子，小滴体积一般为50-200微升。 受精成功观察：将含有受精卵的培养皿放置于倒置显微镜下，卵细胞内出现两个雌雄原核，标志着受精成功。,辅助受精技术,是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，由于一般都需要借助显微操作仪来完成，所以又
21、称辅助受精技术为显微授精(microinsemination) 。,透明带修饰法：运用物理或化学方法对卵母细胞的透明带进行打孔、部分切除或撕开缺口，为精子进入卵黄周隙打开通道，然后把卵子与一定浓度的精子共培养以完成受精过程。这种方法适用于具有一定运动能力，但顶体反应不全，无法穿过透明带的精子。优点是对卵子的损伤小，但对于靠透明带反应阻止多精入卵的动物易造成多精子受精，影响胚胎继续发育。,透明带下注射法： 用微注射器将3-5个精子直接注射入透明带下的卵间隙，从而使卵子受精。 优点是对卵细胞的损伤小，已在临床医学上得到运用，但也存在多精受精问题。 卵桨内精子注射法：用微注射器将单个精子直接注射入到
22、卵细胞的细胞质内使卵子受精。这样可以避免多精受精问题。但是精子质量是重要问题。,4、胚胎培养,受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期才能进行移植。目前人们还不能在体外模拟子宫内的环境供胚胎继续发育。通常情况下，移植的较佳时期是发育至8-16细胞期的胚胎。 培养液中成分除无机和有机盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。,发育阻滞问题,体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞(Developmental block) 。 发育阻滞是胚胎体外培养的一个主要障碍。造成胚胎发育阻滞的因素比较复杂，既有胚胎
23、发育本身因素，也有培养环境的客观因素。体外培养条件与体内发育条件的差异造成了胚胎发育被阻断。,5、胚胎移植,将胚胎移植到另外一头与供体同时发情排卵但未经配种的母畜（称为“受体”）的相应部位（输卵管或子宫角）。 这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。这就是通常所说的“借腹怀胎”。,手术法：将同期化处理后的受体动物仰面固定在手术床上，全身麻醉，腹部切口，将一侧卵巢上有黄体发育的子宫远端拉出，将吸有胚胎的胚胎移植管插入穿刺孔，小心将胚胎输入。 这种方法移卵容易、损伤小、成功率较高。 非手术法: 使用类似于人工授精的专用输胚枪， 将其直接插入排卵侧子宫角内，注入
24、胚胎。,6、体内发育、出生,胚胎移植后处理与观察：胚胎移植后需补充黄体 酮，目前多采用注射法给予黄体酮。 胚胎移植后14天可由验尿或抽血确定是否妊娠 。 如果确定妊娠，则改用hCG继续补充到怀孕10周。妊娠后14天B超检查胎儿数及胚胎着床部位。,四、动物性别控制,所谓性别控制，就是通过人为干预或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。,性别决定机制,多数动物的性别是由性染色体决定的。 以人为例：XX女；XY男。 在人Y染色体短臂发现了个单拷贝基因称为Y染色体性别决定区基因（Sex determining region Y gene ，SRY）Y染色体短臂上一段SRY基因决定人的性别。 XX染色体缺少S
25、RY基因，染色体上DSS位点基因转录促进卵巢发育，形成雌性。,性别控制途径,性别控制主要有两条途径： 1、受精前性别控制：选择X、Y精子 2、胚胎移植前性别控制：在移植前对胚胎进行性别鉴定，然后对所需要性别的胚胎进行移植，从而达到控制后代性别的目的，这是动物性别控制较为实用的方法。,1、X-Y精子的分离,X-Y精子在物理和化学上存在差异，例如：精子 的耐酸碱性。Y精子有嗜碱性，而X精子有嗜酸性。 可以采用相应的方法分离，选择相应的雄性配子，进行体外受精，就可以实现性别控制。,离心分离法,X精子DNA含量略大于Y精子，因此X精子密度较Y精子略大，因此可以采用离心分离。 优点：分离时间短、对精子损
26、伤小。 缺点：是因为X、Y精子密度相差不大，分离困难，对仪器精度要求高。,电泳分离法,利用精子表面电荷差异采用电泳进行分离。精子带负电荷，Y精子负电荷略小于X精子，因此在中性缓冲液中，X精子向阳极移动的速度较快。 优点是操作方便，缺点是分离效率不高。,免疫学分离法,Y精子上存在雄性特异性组织相容性抗原（H-Y抗原），利用H-Y抗体检测精子质膜上是否存在H-Y抗原，以此分离X精子（H-Y抗原阴性）和Y精子（H-Y抗原阳性）。 主要有免疫亲和柱层析法和免疫磁珠法。目前这 个方法仅限于小规模实验研究，准确性较低。,流式细胞仪分离法,根据X、Y精子上DNA含量的微小差别，通过流式细胞仪(Flowcyt
27、ometer)进行分离。 首先将精子稀释并与荧光染料Hoechst 33342混合，这种染料可以定量地与DNA结合。精子通过检索仪时被激光束激发，由于X精子比Y精子含较多的DNA，X精子放射出较强的荧光信号。 放射出的信号通过计算机系统分辨X精子和Y精子。,2 、胚胎性别鉴定,细胞生物学方法：通过判定胚胎细胞性染色体是还是来鉴定胚胎的性别。 分子生物学方法：根据Y染色体上的SRY基因的有无进行鉴别，可以采用PCR或FISH等分子方法进行确定性别。 免疫学方法：H-Y抗原。,本章小结,1、卵子发生与精子发生有什么异同？ 2、何为顶体反应？它在精卵结合中如何发挥作用？ 3、体外受精动物的培育流程？,
