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1、 西华大学毕业论文毕 业 论 文题 目:有机白萝卜表皮附生乳酸菌链霉素抗性分析 学院(直属系 ): 食品与生物工程学院 年级、专业 : 2011 生物工程 学 生 姓 名: 学 号: 312011081801301 指 导 教 师: 完 成 时 间 : 2015 年 5 月 20 日 西华大学毕业论文目 录摘 要 1Abstract.11 前言 11.1 抗生素的定义 .11.2 抗生素的用途简介 .11.3 萝卜表皮附生乳酸菌 .11.4 链霉素 .11.5 16S rRNA 分析技术在乳酸菌分类学的应用 11.6 本论文研究的目的及意义 .12 材料和方法 12.1 材料和仪器 .12.1

2、.1 样品 12.1.2 试剂 12.1.3 仪器 12.1.4 培养基及配制 12.2 实验方法 .12.2.1 乳酸菌的培养 12.2.2 乳酸菌的分离纯化 12.2.3 乳酸菌总 DNA 的提取 .12.2.4 16S rRNA 目的基因的 PCR 扩增及克隆分析 .12.2.5 最小抑制浓度（MIC）的测定 13 结果 13.1 乳酸菌的分离 .13.2 基因组 DNA 的提取 13.3 16S rRNA 的 PCR 扩增片断电泳结果分析 13.4 重组子的筛选和鉴定 .13.5 16S rRNA 分析 13.6 链霉素抗性分析结果 .14 结论 1总结与体会 1致谢词 1参考文献 1

3、1西华大学毕业论文摘 要以市售的有机白萝卜为研究对象，分析其表皮附生的乳酸菌对链霉素的抗药性。分离菌株的 16S rRNA 和抗药性分析表明：从有机白萝卜表皮分离得到的 43 株菌分别属于 Pediococcus pentosaceus（44%） 、Leuconostoc mesenteroides（16% ） 、Leuconostoc pseudomesenteroides（5%） 、Leuconostoc citreum（16%） 、Leuconostoc holzapfelii（14%）和 Weissella cibaria（5%） 。在分离得到的 43 株乳酸菌中，共有 8 菌株表现出

4、了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的 18.6%；其中，在 19 株 P. pentosaceus 中，有 5 株菌表现出对链霉素的抗药性；L. mesenteroides 和 L. pseudomesenteroides 对链霉素都表现为敏感；L. citreum、 L. holzapfelii 和 W. cibaria 分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。【关键词】有机白萝卜；乳酸菌；链霉素；抗药性2西华大学毕业论文AbstractThe epibiotic lactic acid bacteria (LAB) on the surface of organic radish were in

5、vestigated by MRS culture, 16S rRNA and antibiotic resistance. 43 isolates in current study were assigned to Pediococcus pentosaceus (44%), Leuconostoc mesenteroides (16%), Leuconostoc pseudomesenteroides (5%), Leuconostoc citreum (16%), Leuconostoc holzapfelii (14%) and Weissella cibaria (5%). And

6、8 (18.6%) isolates displayed the resistance of streptomycin. Among the Pediococcus pentosaceus, there were 5 isolates resistances of streptomycin. For Leuconostoc mesenteroides and Leuconostoc pseudomesenteroides, all of them were sensitive to streptomycin. In the Leuconostoc citreum, only one isola

7、te displayed the resistance of streptomycin; Regarding the Leuconostoc holzapfelii, 1 isolate was resistance; For the Weissella cibaria, 1 isolate was resistance.Keywords: Organic white radish; Lactobacillus; streptomycin; resistance3西华大学毕业论文1 前言白萝卜是根菜类的主要蔬菜，属十字花科、萝卜属的一年或二年生草本双子叶植物 1。在我国白萝卜栽培历史悠久，是一

8、种药食同源的大众化蔬菜，富含维生素 C、芥子油、淀粉酶和粗纤维，具有促进消化，增强食欲，加快胃肠蠕动和止咳化痰的作用，可以治疗或辅助治疗多种疾病，为食疗佳品，被本草纲目称之为“ 蔬中最有利者 ”，因此常被作为水果而鲜食 1。乳酸菌是蔬菜表面常见的附生微生物，长期以来被普遍认为是安全 2。然而，近年来越来越多抗生素抗药性乳酸菌被发现具有一定可转移的抗药性，为乳酸菌的安全敲响了警钟。1.1 抗生素的定义抗生素（antibiotics ）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗

9、生素有转基因工程菌 3培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下万种。1.2 抗生素的用途简介抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，通常将抗菌素改称为抗生素。抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人工合成的。通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种非病毒感染的药物。 但是在临床使用中已经显现了许多副作用。1.3 萝卜表皮附生乳酸菌乳酸菌（lactic acid bacteria）是一类无芽孢、革兰氏染色阳

10、性细菌的总称，它属于发酵糖类，其主要产物为乳酸。乳酸菌是一群细菌，它们数量相当庞大，种类异常复杂，到目前为止共发现有200多种，并分成了18个属。其中相当大的一部分都是我们人体所必须并具有重要生理功能的菌，而且人体的肠道中大量4西华大学毕业论文存在着这些菌。并且国内外生物学家都认为人类身体的健康程度和生命的长短都与肠道中的乳酸菌有着非常密切的关系。乳酸菌的发酵原理是：乳酸菌进行无氧呼吸，葡萄糖即经过糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸再脱氢产生乳酸。乳酸菌可将酪蛋白被分解成肽和氨基酸，而且乳糖和柠檬酸可生成芳香性物质，从而产生风味。乳酸球菌和乳酸杆菌对蛋白质有较强的分解能力，是高酸生成菌。乳酸菌还有分解脂

11、肪的能力，三丁酸甘油酯易被乳酸菌发酵剂分解。1.4 链霉素链霉素属于抗生素中氨基糖苷类。链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式 C21H39N7O12。 1943 年美国 S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳

12、定。硫酸链霉素制剂外观为黄色粉末，密度 0.38g/L，pH1.5 3.5，易溶于水，呈微酸性，在中性和酸性条件下稳定，碱性条件下易失效。1.5 16S rRNA 分析技术在乳酸菌分类学的应用16S ribosomal RNA是16S rRNA 的全名，它是原核生物的一种核糖体RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。由于其种类少，普遍性存在，分子大小适中，总量一般占细菌rRNA总量的80 %左右，在结构与功能上具有高度的保守性和特异性，基因序列一般包含约50个功能域，基因序列的变化缓慢，所以将16S rRNA 用作分子指标, 这样能实现微量、快速、准确、简便的对乳酸菌进行分类鉴定。16S

13、rRNA中的“S“ 是沉降系数，反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标。此沉降系数分为3种：5S 、16 S 和23 S，他们对应的编码基因（rRNA）的链长为3300、1540、120个核苷酸，细菌蛋白质的合成过程是由它们和核糖体大小亚基组合在一起共同完成的。16S rRNA基因是细菌上编5西华大学毕业论文码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S rRNA 基因片段一般有 3 种分析方法: 第一种是，将 PCR 产物与16S rRNA 种属特异性的探针杂交，从而获取微生物组成信息。样品与探针也可以直接进行原位杂交检测，这样既能分析它们的空间分布，还能测定微生物的

14、丰度和形态特征。此方法优点是简洁方便， 通常大量应用于快速检测,。缺点是可能出现假阴性或假阳性结果。第二种是在质粒载体上将PCR 产物克隆，然后进行测序。通过将结果与16S rRNA 数据库中的序列进行比较的方法，找出它在进化树中的位置，这样就可以鉴定出萝卜表面乳酸菌中存在的乳酸菌种类,。此方法优点是获得的信息比较全,缺点是如果成分太复杂，工作量会很大。第三种是，对PCR 产物进行限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism s,RFLP)分析, 然后观察其酶切电泳图谱和数值分析来确定萝卜表面乳酸菌基因的核糖体型, 然后与核糖体库中的数

15、据进行比较，这样可以分析不同种属之间的关系。随着分子分类的方法和理论的日渐成熟，16S rRNA分析技术成为了微生物分类学研究的一种可靠的工具。细菌主要是根据是细菌生理、生化性状和形态特征进行分类, 采用的对乳酸菌进行纯培养分离方法，然后鉴定其生理、生化、形态、反应特征和免疫学特性 4-5。1.6 本论文研究的目的及意义随着人们生活水平逐步提高，人们越来越重视食品安全问题。有机蔬菜纯天然、不含任何农药残留，通常被称为“零污染”的蔬菜，因此备受消费者青睐。然而，近年来越来越多抗生素抗药性乳酸菌被发现具有一定可转移的抗药性，为乳酸菌的安全敲响了警钟。该研究以期待为有白机萝卜鲜食的食品安全评价提供参

16、考。2 材料和方法2.1 材料和仪器2.1.1 样品6西华大学毕业论文有机白萝卜样品购买于成都有机蔬菜种植基地零售超市。2.1.2 试剂2.1.2.1 DNA 提取与检测试剂表 1 DNA 提取与检测试剂试剂 生产厂家ddH2O 北京奥博星生物技术有限责任公司TE Buffer 北京奥博星生物技术有限责任公司10%（W/V ）SDS 北京奥博星生物技术有限责任公司20 mg/mL 蛋白酶 K 北京奥博星生物技术有限责任公司5M NaCl 北京奥博星生物技术有限责任公司CTAB/ NaCl 溶液（pH8.0） 成都市科龙化工试剂厂241 氯仿/异戊醇 成都市科龙化工试剂厂25241 苯酚/氯仿/

17、异戊醇 成都市科龙化工试剂厂异丙醇 成都市科龙化工试剂厂无水乙醇、70%乙醇 成都市科龙化工试剂厂电泳级琼脂糖 成都市科龙化工试剂厂核酸染色剂 成都市科龙化工试剂厂DNA Marker I, DNA Marker VII 成都市科龙化工试剂厂2.1.2.2 PCR 扩增试剂表 2 PCR 扩增试剂PCR扩增试剂 生产厂家4种底物：dNTP (dATP+dCTP+dGTP+dTTP) Tiangen公司10Taq 缓冲液 Tiangen公司Taq DNA polymerase ( 5.0U/l ) Tiangen公司MgCl2（25mM） Tiangen公司PCR mixture 东盛公司7西华

18、大学毕业论文2.1.2.3 16S rRNA 目的基因的 PCR 扩增表 3 16S rRNA 目的基因的 PCR 扩增试剂16S rRNA目的基因的PCR扩增试剂 生产厂家10PCR buffer； 东盛公司脱氧核苷酸（dNTP 混合物）； 东盛公司Taq DNA 聚合酶； 东盛公司DNA 模板； 东盛公司引物P1:Eu27f, AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 东盛公司引物P2:1490R, GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 东盛公司三蒸水 东盛公司2.1.3 仪器表 4 实验所用仪器及设备仪器 生产厂家IS09001 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有

19、限公司BCD-155TD GA 冰箱 青岛海尔股份有限公司DSX-280B 手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 宁波甬安医疗器械制造有限公司LDZX-75KB 立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂SW-OJ-LF 洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司PTC-200 型 PCR 扩增仪 美国 MJ Research 公司DYCP-31DN 型琼脂糖水平电泳仪 北京六一仪器厂GEL DOC XR 型凝胶成像分析系统 美国 Bio-Rad 公司2.1.4 培养基及配制2.1.4.1 MRS 培养基配制方法（配制量 1 L）(1) 称取酵母粉 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐温8

20、0 1mL，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2g，碳酸钙20g8西华大学毕业论文于1 L的烧杯中；(2) 加入约800mL （80%）去蒸馏水，加热充分搅拌溶解；(3) 滴加1mol/LNaOH ，调节 pH至6.56.8；(4) 加去蒸馏水至 1L；(5) 加入15g琼脂，高温高压灭菌（121灭菌30min），待冷却至60左右时摇匀倒平板，每个平板的培养基加20mL左右，平板制成后保存于4。2.1.4.2 MRS 液体培养基(1) 称取酵母粉 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸锰0.05g，

21、硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2g于1L的烧杯中；(2) 加入约800mL （80%）蒸馏水，加热充分搅拌溶解；(3) 滴加1mol/LNaOH ，调节 pH至6.56.8；(4) 加蒸馏水至 1L，充分搅拌均匀后，分装入试管中（5mL/ 支）；(5) 高温高压灭菌（ 121灭菌30min），保存。2.2 实验方法2.2.1 乳酸菌的培养随机选取有机白萝卜表皮 25 g 放于 225 mL 无菌生理盐水中，振荡 30 min，制成细菌原液。用移液枪取 900l 无菌水于 EP 管中，再取 100l 细菌原液，混合均匀记为 1:10；吸取 1:10 的细菌液于 900l 无菌水中混匀制成 1:100

22、细菌液；吸取 1:100 的细菌液于 900l 无菌水中混匀制成 1:1000 细菌液; 吸取1:1000 的细菌液 900l 无菌水中混匀制成 1:10000 细菌液。配制液体MRS培养基200mL，灭菌后倒10个平板，待其冷却凝固后于恒温箱过夜，用移液枪取100l 菌种于平板，用玻璃涂棒将菌种涂均匀，作好标记，每个浓度的细菌液接两个平板，于37恒温箱培养48h 6。2.2.2 乳酸菌的分离纯化在MRS固体培养基中加入碳酸钙，将菌种稀释至合适的浓度，均匀涂布于加入碳酸钙后的固体培养基，37恒温培育48h。乳酸菌会在含有碳酸钙的培养基上产生溶解圈，观察挑选有碳酸钙溶解圈的单菌落（最好挑一些溶解

23、圈半径9西华大学毕业论文较大的），然后在MRS 固体培养基上反复划线，直到分离长出单菌落。将分离的单菌落编号菌种在MRS 固体培养基上，保藏温度 4，备用。2.2.3 乳酸菌总 DNA 的提取(1) 将已培养至饱和的细菌液吸取 2.0mL，10000rpm 离心 2min，弃上清，加 ddH2O 无菌水洗涤，10000rpm 离心 2min，弃上清；(2) 沉淀物加入 555 l TE buffer，充分悬浮（不能有菌团），加入40 l 10 SDS和5 l20 mg/mL蛋白酶K，悬振混匀，37温育1h；(3) 加入100l 5M的 NaCl，混匀，再加入80l CTAB/NaCl 溶液，混

24、匀，70温育10 min；(4) 加入780l 241氯仿 /异戊醇，混匀，4，12000rpm离心5min，上清液转入新管中，弃废管；(5) 加入等体积的 25241 酚/氯仿/异戊醇（注意取下层溶液），混匀，4，12000rpm离心5min，上清液转入新管中，弃废管；(6) 加入0.6体积的异丙醇，轻轻混匀，4静止2h，4，12000rpm 离心10min，弃上清，500l70乙醇洗涤，4，12000rpm离心10min，弃上清；(7) 真空干燥 10min，加入 TE buffer 30l 溶解，-20 保存 7。2.2.4 16S rRNA 目的基因的 PCR 扩增及克隆分析2.2.4

25、.1 16S rRNA 目的基因的 PCR 扩增(1) PCR 引物Forward Primer：Eu27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，10M )；Reverse Primer：1490R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ，10M)；(2) PCR 反应16S rRNA 序列的 PCR 反应体系（50l）如表 5表 5 16S rRNA PCR 扩增反应体系PCR 反应试剂 添加量灭菌水(ddwater) 33.75 l10西华大学毕业论文10Taq 缓冲液（冰上解冻） 5 ldNTP( 冰上解冻) 4 lMgCl2（25mM） 3lForward Pr

26、imer 1 lReverse Primer 1 l模板 DNA 2 lTaq DNA 聚合酶(Tiangen，5 U/l) 0.25 l按以下程序在 PCR 自动扩增仪中对目的基因进行扩增：95预热 5 min95变性 1 min50退火 1 min 35 cycles72延伸 2 min72延伸 10 min反应结束后，20保存。(3) 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物取 PCR 扩增后的产物 5 l，加 1 l 6 loading buffer 混匀，上样于 1.0%的琼脂糖凝胶，电泳检测扩增效果。DNA Marker VII 5 l 作标准，1 TAE 缓冲液介质，4 10 V/cm

27、直流电电泳。2.2.4.2 连接反应（Ligation)和重组 DNA 的转化从 PGM-T ligation Kit 剂盒（ Tiangen 公司）1 l 连接缓冲液加入到 200 l的 Eppendorff 管中。然后加入扩增后的 DNA 片段 4 l，再加入 pGM-T 载体 1 l ，再加入 3 l ddH2O， T4 DNA ligase 1 l 轻轻混匀后（注：以上添加溶液顺序不能颠倒）在 PCR 仪中 16过夜连接。连接结束后取 3 l 重组质粒 DNA 加入到冰上已解冻的装有感受态大肠杆菌 DH5 Eppendoff 管中，轻轻混匀，冰上放置 30 min，42热激 90s，迅

28、速置冰水浴中 2 min，加入已经在 37预热的SOC 培养基 300500 l， 37摇床培养 45 min。11西华大学毕业论文2.2.4.3 重组菌落的筛选向含氨苄青霉素的 LB 培养基平板培养皿中加入 40 l X-gal 和 30 l IPTG后涂布平板，37放置 13 h，加入 100 l 重组大肠杆菌液涂在 LB 平板上。Eppendoff 管中剩余的 400 l 重组大肠杆菌 DH5 在 4 12000 rpm 下离心 1 min，倒掉上清液约 300 l，微型震荡仪上悬震菌体沉淀，吸取菌悬液涂于新的LB 平板。涂好后的平板在 37培养 15 h 左右，挑选白色的菌落。2.2.

29、4.4 重组大肠杆菌的扩大培养将 LB 液体培养基分装入试管中，每管约 4 mL，121，灭菌 20 min，冷却后每管加入 5 l 氨苄青霉素（25 mg/mL） 。用无菌牙签挑取白色的单菌落接种于试管中，37，150 rpm 震荡培养 1518 h，直至从试管另一面看不到牙签即可。2.2.4.5 重组质粒的提取和鉴定质粒的提取参见质粒小提试剂盒（Omega 公司）的说明操作，步骤如下：(1) 柱平衡步骤：向吸收柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中）加入 500 l 的平衡液 BL，12000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(2) 取 1.5 mL 在

30、2.2.4.4 中培养的大肠杆菌，加入到 Eppendorf 管中，使用普通离心机，12000 rpm 离心 1 分钟，尽量去除上清液。(3) 向留有菌体沉淀的 Eppendorf 管中加入 250 l 溶液 P1（先确认是否已加入 RNaseA） ，使用旋涡混匀器彻底悬浮菌体沉淀。(4) 向 Eppendorf 管中加入 250 l 溶液 P2，温和的上下翻转 4-6 次使菌体充分裂解。(5) 向 Eppendorf 管中加入 350 l 溶液 P3，立即上下翻转，充分的混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000 rpm 离心 10 分钟，此时在离心管底部形成沉淀。(6) 小心的将上清液用移液

31、枪转移到吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中） ，注意尽量不要吸出沉淀。室温放置 12 分钟，12000 rpm 离心 30 60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(7) 向吸附柱 CB3 中加入 700 l 漂洗液 PW（先确认是否已加入无水乙醇） ，12西华大学毕业论文12000 rpm，离心 30 60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装入收集管中。(8) 向吸附柱 CB3 中加入 500 l 漂洗液 PW，12000 rpm（-13400g）离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液。(9) 将吸附柱重新装入收集管中，12000 rpm 离心 2 分钟。(10) 将

32、吸附柱 CB3 放置于一个干净的 Eppendorf 管中，向吸附膜的中央部分滴加 50 100 l 洗脱缓冲液 EB，室温放置 1 分钟，12000 rpm（-13400g）离心 2 分钟将质粒溶液收集到 Eppendorf 管中。(11) 为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入带有吸附柱的Eppendorf 管中，重复（ 10）的操作。(12) 将上面收集到的质粒 DNA 保存在-20 备用。(13) 限制性内切酶处理质粒 DNA：在 1.5 mL 的 Eppendorf 管中加入灭菌水 1.5 l/管、 酶 EcoR I 1 l/管，然后再加入质粒 DNA 2 l/管，用手指轻轻弹

33、匀，小型离心机上离心使管壁上的液体落入管底，37酶切 1 h，电泳检测。2.2.4.6 DNA 序列的测定该部分送往成都博瑞克生物技术有限公司完成。2.2.5 最小抑制浓度（MIC）的测定根据欧洲抗微生物药物敏感委员会关于微生物对不同抗生素敏感阈值 X 的数据库分析菌株的抗生素抗药性。当分离菌株的最小抑菌质量浓度(Minimal Iinhibitory Concentration, MIC) Xg/mL 时为敏感性菌株，反之当 MICXg/mL为抗药性菌株。最小抑制浓度的测定采用微量肉汤稀释法。培养液制备：在 2mL MRS 液体培养基中接种从平板上挑取的单菌落，然后在 30环境中静止培养过夜

34、，然后用生理盐水稀释至每毫升 1107 个细胞的浓度，即得到培养液。将 STR 配制成 2048g/mL 的贮存液，MRS 液体培养基 2 倍梯度稀释成使用液。STR 的梯度稀释浓度为 21024g/mL。向 96 孔板中加入 198L 含不同浓度抗生素的 MRS 液体培养基后，接种 2L 分离菌株的培养液13西华大学毕业论文（110 7CFU/mL） ，37静止培养 24h 后，统计不同菌株的 MIC，每组实验重复 3 次并设置空白对照。3 结果3.1 乳酸菌的分离乳酸菌是指发酵时能够产生乳酸的一大类细菌，包括 40 个属，近 300 个种。MRS 平板分离乳酸菌时，利用其产生的乳酸溶解 C

35、aCO3 形成溶钙圈的特性，实现乳酸菌的初步分离。在当前研究中，从平板中分离得到 43 个溶钙圈菌落，编号为为 LS1 到 LS43。3.2 基因组 DNA 的提取DNA 作为分子生物学研究的基础,在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入，在此基础上产生的基因工程技术已在医药、畜牧业等领域获得广泛应用。研究和应用 DNA 的基础是提取纯化结构完整的 DNA，实验中将 SDS 法和CTAB 法结合用于 DNA 的提取，不仅能 使微生物细胞能更完全的得到破碎，并有利于蛋白质等杂质与 DNA 的分离。实验结果如图 4。图 3 Wide Range DNA Marker 图 4 部分乳酸菌的总 DNA

36、 电泳结果图由图 4 可看出每条泳道均出现清晰的条带且与 Marker 的条带基本一致。实验中染色剂 Gold-view 中所含有的 EB 嵌入核酸双链的碱基之间，形成 EB-DNA14西华大学毕业论文复合物。该复合物，经紫外光照射，可以发出红-橙色的荧光。1 ng 的 DNA 即可检出。由电泳亮斑可知，细菌基因组 DNA 的大小超过 12 kb，因此，则可认为达到了对基因组 DNA 的提取要求。3.3 16S rRNA 的 PCR 扩增片断电泳结果分析所有样本菌的 16S rRNA 基因皆进行了 PCR 扩增，扩增后电泳检测的结果如图 6 所示。图 5 DNA Marker III 图 6

37、16S rRNA 的 PCR 扩增电泳图（部分） 由图 6 电泳亮斑可知，对所有样本菌的 16S rRNA 基因皆进行了 PCR 扩增。所扩增片段的大小在 1200 2000 bp 之间，和原核生物的 16S rRNA 基因片段大小一致，因此达到了对微生物的 16S rRNA 基因的 PCR 扩增目的 8。3.4 重组子的筛选和鉴定以 Taq DNA 聚合酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单个碱基 A，pGM-T 载体，其结构图谱如图 7 所示，具有一个 T 碱基的粘性末端，它们既可按碱基互补配对原则，将目的片段与载体相连，构建成重组子。pGM-T 载体不仅含有多克隆酶切位点，还含丝状噬菌体

38、f1 的复制起始区，用于产生环状 ssDNA；含有 T7 和 SP6 DNA 聚合酶启动子；在多克隆区域具有编码 -半乳糖苷酶的基因（lacZ） ，插入失活 -肽可在指示平板上通过蓝、白菌落直接筛选重组菌落。15西华大学毕业论文图 7 pGM-T 结构图谱本实验采用了内切酶 EcoR对重组质粒进行了切割，EcoR酶的切位点如图 8 所示。阳性重组子经酶切后有 16S rRNA 目的基因片段电泳亮斑，并和DNA Marker 中长度为 1.5 kb 的核酸片段亮斑位置相一致。由检测图 10 可知，连接反应已将 PCR 扩增后的 16S rRNA 基因连接到了 T-载体上，并在感受态菌株 E.co

39、li DH5 中得到了表达，形成白色菌落。图 8 EcoR酶切示意图 16西华大学毕业论文图 9 DNA Marker 图 10 酶切后的质粒电泳图（部分）3.5 16S rRNA 分析通过16S rRNA序列经校对后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度较高的菌株将结果记录如表6。Stackebrandt 9等认为当细菌的16S rRNA序列的相似性大于或等于97%时，则可以认为是同一个属，当序列相似性大于或等于98%时，可以认为是同一个种。从平板上分离得到的43株菌通过16S rRNA序列分析结果表明：有机白萝卜表皮附生乳酸菌主要分为Pediococcus、Leucon

40、ostoc和Weissella属（表6），其中，以LS5为代表的19株分离菌株属于Pediococcus属，它们的16S rRNA序列与 P. pentosaceus DSM 20336T 的16S rRNA序列相似性为 99%，因此以LS5 为代表的19株菌被鉴定为P. pentosaceus，占所有菌株的 44%；以LS2为代表的 7株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA 序列与L. mesenteroides ATCC 8293T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS2 为代表的7株菌被鉴定为L. mesenteroides，占所有菌株的16%；以LS15为代

41、表的2株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA序列与L. pseudomesenteroides NRIC 1777T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS15为代表的2株菌被鉴定为L. pseudomesenteroides，占所有菌株的5%；以LS26为代表的7株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA序列与 L. citreum ATCC 49370T的17西华大学毕业论文16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS26为代表的7株菌被鉴定为L. citreum，占所有菌株的16%；以LS34为代表的6株菌属于Leuconostoc属，它们的16

42、S rRNA序列与L. holzapfelii LMG 23990T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS34为代表的6株菌被鉴定为L. holzapfelii，占所有菌株的14%；以LS17为代表的2株菌属于Weissella 属，它们的 16S rRNA序列与W. cibaria LMG 17699T的16S rRNA序列相似性为100%，因此以LS17为代表的2株菌倍被鉴定为W. cibaria，占所有菌株的5%。表 6 16S rRNA 序列比对结果属 簇 群 相似菌株 相似性 菌株数量Pediococcus LS5 P. pentosaceus DSM 20336T 99%

43、 19LS2 L. mesenteroides ATCC 8293T 99% 7LS15 L. pseudomesenteroides NRIC 1777T99% 2LS26 L. citreum ATCC 49370T 99% 7LeuconostocLS34 L. holzapfelii LMG 23990T 99% 6Weissella LS17 W. cibaria LMG 17699T 100% 23.6 链霉素抗性分析结果查询欧洲抗微生物药物敏感委员会 (http:/www.eucast.org)关于微生物对不同抗生素敏感阈值的数据库（http:/www.eucast.org/mi

44、c_distributions/）可知，P. pentosaceus、 L. mesenteroides、 L. pseudomesenteroides、 L. citreum、 L. holzapfelii和W. cibaria对链霉素的敏感阈值分别是64、64、64、64、64和8；在分离得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的18.6% ；其中，在19株P. pentosaceus中，有5株菌表现出对链霉素的抗药性；L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides 对链霉素都表现为敏感；L. citreum、L. holzap

45、felii和W. cibaria 分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。表 7 有机白萝卜表皮附生乳酸菌对链霉素的 MIC 与抗药性(g/mL)STR菌株阈值 MIC R 或 SP. pentosaceus LS1 64 32 S18西华大学毕业论文LS2 64 SLS3 64 SLS5 64 SLS9 64 SLS14 32 SLS20 128 RLS21 64 SLS22 512 RLS30 64 SLS31 64 SLS33 32 SLS34 32 SLS35 4 SLS36 32 SLS38 128 RLS39 1024 RLS42 4 SLS43 256 RLS4 64 SLS6 64

46、 SLS13 32 SLS19 32 SLS23 16 SLS32 32 SL. mesenteroidesLS376432 SLS15 64 SL. pseudomesenteroidesLS256432 SLS7 32 SLS8 128 RLS11 32 SLS18 32 SLS24 4 SLS26 4 SL. citreumLS29648 SLS10 32 SLS16 16 SLS17 16 SLS28 32 SLS40 32 SL. holzapfeliiLS4164128 RLS12 128 RW. cibariaLS2784 S19西华大学毕业论文注：“R” 代表耐药， “S”代表

47、敏感4 结论从有机白萝卜表皮分离得到的43株菌分别属于Pediococcus 、 Leuconostoc和Weissella属，其中， 19株菌被鉴定为 P. pentosaceus， 占所有菌株的44%；7株菌被鉴定为L. mesenteroides， 占所有菌株的16%；2株菌被鉴定为L. pseudomesenteroides，占所有菌株的 5%；7株菌被鉴定为L. citreum，占所有菌株的16% ；6株菌被鉴定为L. holzapfelii，占所有菌株的14%；2株菌被鉴定为W. cibaria，占所有菌株的5%。在分离得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所

48、有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P. pentosaceus中，有5株菌表现出对链霉素的抗药性； L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides对链霉素都表现为敏感；L. citreum、 L. holzapfelii和 W. cibaria分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。20西华大学毕业论文总结与体会通过本次论文，我很好的总结了四年大学的学习，并将所学的知识很好的应用到了实验中，对自己的理论应用能力有了很好的锻炼和提高。毕业设计不仅是对大学前三年所学知识的检测，也是对自己的思维和实验能力的一种锻炼，并使之有所提高。通过这次毕业设计我发现原来自己学的知识

49、是比较有限的，而且真正要自己设计一个实验，并亲手把它做出来，是已经很不容易的事，还需要学习的东西很多。在实验过程中遇到了很多困难，一开始不知道怎么下手，通过指导老师和师兄的帮助，我渐渐进入了毕业设计的正轨。我也明白了：知识必须通过应用才能实现其价值，学以致用，是一个提升的过程。这次毕业设计既锻炼了自己独立思考的能力、与人合作的能力和应对困难的心理，还在理论知识和实验技能上得到了提高。此次实验是在西华大学生物工程古法发酵生物技术研究所内完成，实验室给我的第一印象是学风严谨，这次试验的全过程中我也一直感受着这个优良的作风。实验室的老师和师兄对待科学的严谨和钻研精神让我受益非浅，我将以后在的学习和生活中都本着严谨刻苦的精神进行。21西华大学毕业论文致谢词本论文能顺