1、证明一个药物能通过抑制 P38 表达而发挥保护细胞的作用，需要做的是：要证明你的药物是通过抑制 P38 表达而发挥保护作用，首先要证明 P38 表达增加会导致损伤。其次，要证明你的药物存在保护作用。再次，证明你的药物可以抑制 P38 表达。最后，证明你的药物是由于抑制了 P38 表达而发挥保护作用。首先证明 P38 表达增加会导致损伤。这里需要建立一个损伤模型。正如你提到的，钙离子导致 P38mapk 的增高，如果某种损伤可以通过钙离子导致 P38mapk 的增高，那么你就建立起了一个损伤模型。这时，对 P38 做个 RNA 干扰，使其表达下降，再来损伤刺激，如果这时损伤刺激不会导致损伤，那么
2、可以说 P38mapk 的增高会导致损伤。这里最好不要用 P38 的抑制剂 SB 来处理，因为这个抑制剂是针对 P38 活性的抑制剂，抑制的是 P38 的磷酸化，而不是表达量。如果说明的问题是 p38 磷酸化水平增加而导致损伤，那么我建议用抑制剂。这时还可以用Dominant-negative。抑制剂的实验证实该药物不影响 P38 表达，而影响其活化。 （应该首先考虑选用抑制剂，因为目前一些药物的作用机制不是抑制靶点的表达，而是抑制靶点的激活。如果在此应用 RNAi 的话，很可能会漏掉这个机制或增加实验步骤。 ）其次，要证明你的药物存在保护作用。当然就是用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，如果
3、这时损伤刺激不会导致损伤，那么可以说你的药物存在保护作用。再次，证明你的药物可以抑制 P38 表达。用你的药物先处理一下，再来损伤刺激，再检测 P38 表达，如果用药组相对于没有用药组P38 表达下降，那么可以说你的药物可以抑制 P38 表达。最后，证明你的药物是由于抑制了 P38 表达而发挥保护作用。这一步看似不必要，其实是最重要的步骤，而国内的文章往往忽略了这一关键环节。这里建议还是用 RNA 干扰 P38 表达，再用你的药物处理，再进行损伤刺激，如果用药组与没有用药组的损伤程度一致，那么才可以说你的药物是由于抑制了 P38 表达而发挥保护作用。抑制剂也有其局限性，有时是“致命”的，主要原
4、因是抑制剂缺乏特异性。虽然我们在文章里看到用抑制剂的时候都说是什么什么的特异性抑制剂，但真的那么特异吗？其实往往是作者为了写文章发文章的需要而夸大了抑制剂的特异性。细胞里无数的信号通路，谁也不能保证抑制剂在作用于靶分子时不会影响其他信号通路。其实无论什么抑制剂，对剂量的要求都相对比较苛刻，为什么？就是因为一旦浓度高了，就不知道会干扰到其他哪些信号通路，从而产生很多说不清道不明的现象。PI3K 的抑制剂-LY294002 和 wortmannin,它们都能抑制 PI3K 和相关的激酶，但 LY294002 的浓度达到 200M 常用来抑制 DNA 依赖的蛋白激酶（DNA-PK ） ；wortma
5、nnin 在浓度超过3 M 常用来抑制运动失调性毛细血管扩张基因突变（ATM)以及 DNA-PK。相对而言，MEK1/2 的抑制剂 U0126 和 PD98059 以及 P38MAPK 的抑制剂 SB203580 就要好一些。所以研究人员一般应用 LY294002 时采用 20M ，应用 wortmannin 时采用 0.2M，以此来最小化其他的效应。有些学者们同时应用两种抑制剂进行对比，也许也有顾及于此的原因吧。但是，从严谨的角度讲起特异性的话，RNAi 也不能说是绝对特异的，我们只能说它是高特异性，因为 RNAi 的机制中还有很多没有完全阐明。 一些研究者会在 RNAi 处理后，还要在实验
6、中应用 Western 来同时检测该蛋白所在家族的其他成员的表达量变化以检测其特异性和选择性，以表严谨。举个例子：比如针对 Survivin 进行 RNAi 之后，你最好同时检测 XIAP , cIAP1/2 等蛋白。当然，如果你所针对基因的 siRNA 构建已经很成熟，有前人的文章检测特异性做基础，那就另当别论了，所以给科研态度很严谨的 lwjssry 兄弟提个醒，如果你的 siRNA 序列尚无很好的文献应用基础，这个问题你也许应该考虑的。临时找到一个描诉相关内容的 06 年文献，影响因子 3 分多，截取其中的内容供 lwjssry 兄参考吧：信号通路有细胞特异性和条件特异性，即同一信号通路
7、在不同的细胞之间或同一细胞在不同的条件下，作用机理可能是不同的。细胞内的信号通路之间存在复杂的相互作用，想证明哪一个分子是另一分子的充要条件真的很难。本人最近研究了一个信号系统的两个信号分子，A 和 B。A 在细胞质，B 在细胞核。以往的研究已经证明 A 是 B 的上游信号通路之一。我们的研究是想证明在某种病理过程中A 和 B 作为一个系统发挥作用。我们首先应用能够提升该系统的药物干预，发现 A 升高的同时 B 也得到升高，但这也不能说明什么问题。所幸的是 A 分子目前有特异性的阻断剂，于是我们便对 A 分子的激活进行阻断，结果发现 B 分子的激活也收到抑制。由此初步推测A 和 B 可能在某种
8、病理过程中作为一个系统发挥作用。但也只能证明了 A 是 B 的必要条件而已。做信号传导的在于你研究一种的机制有什么作用，其机制是否于信号传导有关，有哪些关系，是什么原因导致此信号传导的表达，表达后的下游基因怎么变化？这中间最好有基因敲出或者抑制剂和激动剂干预后看看上游 下游之间的变化和你预期的结果有没有关系。如果单纯的做信号传导而去做没有什么意义的，就像前面楼上说的一样信号的启动/最终发挥功能！“想证明哪一个分子是另一分子的充要条件真的很难” 。我最近正在做一个实验，证明 A对 B 的作用。先用外源物处理细胞，跑 wetern blot，发现 A 和 B 都有所增加，B 的量增加在 A 之后。
9、于是用抑制剂抑制 A，以及用 siRNA 使 A knockdown，然后看 B 的表达量也下来了。但是这也只能证明 A 和 B 有关联，无法证明 A 对 B 是直接作用还是间接作用。甚至无法说明 B 的改变是 A 信号 knockdown 造成的，还是 A 信号 knockdown 以后，细胞为了弥补该信号的不足，补充促进了 C 信号，而 C 信号可以改变 B 信号。最近在考虑用 Co-IP证明 A 和 B 有结合作用，也许能证明 A 和 B 的直接关系。探讨信号转导中分子间的充要条件，与探讨数学中的充要条件是不一样的，因为细胞中信号转导通路往往存在反馈机制。即使 X 是上游信号，Y 是下游
10、信号，改变 Y 信号也会通过反馈机制使得 X 信号发生改变。所以，在考虑生物体内的信号分子间充要条件时会复杂得多，要慎之又慎下结论。信号分子的环路效应普遍存在个人觉得研究 A 分子与某个信号通路应该更具体得分为两种情况：1，以前还不知道 A 分子是这个信号通路的成分，这时我们要证明 A 分子是这个信号通路的成分，这时的研究就是上文谈到的研究内容了。2， A 分子是信号通路的成分，这是已知的，现在发现某个现象跟这个通路有关，现在我们要证明 A 分子是这个信号通路参与这个现象的关键分子，则又是另一种模式。1， “创造信号通路” ，别人没有研究过 A 和 B 之间的相互作用，而你发现了，并证明了，这
11、就是创造，其实准确点说应该是“发现” ，因为信号通路是客观存在的，只不过被找到了而已，不过用“创造”这个词比较形象。这一类的研究是开创性的，比较困难的，研究的时候常常是用免疫共沉淀去把与某个蛋白结合的一堆蛋白都搞出来，再做质谱分析，进行鉴定，再进一步证明两者间的相互作用，这就涉及到充分必要条件的证明。单纯进行这一类的研究缺乏目的性和研究的意义，所以通常还是建立于某种现象基础上的，用自己“创造”的信号通路来解释某种现象，也就是下面说的第二种模式。2， “利用信号通路” ，利用别人或自己 “创造”的信号通路来解释某个具体的现象，比如，某个药物、某种毒物、某种应激、某种射线、等等，在这些刺激下，具体
12、到某种细胞的某条信号通路发挥调控作用。在第一类中，是用充分必要条件来证实 A 分子与 B 分子的作用。在第二类中，是用充分必要条件来证实 A 现象与 B 信号通路之间的关系。看文献是最基础的训练，看文献，一是看思路，二是学技术和逻辑思维。思路告诉我们为什么去做，技术和逻辑思维教我们怎么去做。过表达 A 基因，发现 B 基因的 mRNA 水平明显增加，对应的 B 的蛋白水平也明显增加；干扰 A 基因表达，发现 B 基因的 mRNA 水平明显降低，对应的 B 的蛋白水平也明显降低。投稿，被拒稿，主要原因是审稿人提出：应该弄清楚 A 是如何调控 B 的表达的。请问各位老师，A 调控 B 可能是通过什
13、么途径？需要做什么实验？A 和 B 都是脂类代谢中的酶基因，它们在胞浆和核内都有表达。回答：1、下一步应该搞清楚 B 基因 mRNA 改变的原因是什么，在转录水平还是影响了 RNA 的稳定性。2、假设 A 和 B 是直接关联的（假定 A 影响 B 的转录） ，是否一般得做两个实验： Luciferase reporter assay 和 CHIP assay？只做一个 CHIP 实验行不行？其中 Luciferase reporter assay 是否就是为了检验 A 蛋白是否能结合到 B 基因的 Promoter 区？是不是 A 蛋白必须得是转录因子才有可能结合到 B 基因的 Promote
14、r 区？另外，怎么知道 A 蛋白是不是转录因子呢？针对这个问题的回答：不过建议找几篇 JBC 上的文章看看， JBC 上这种调调的文章挺多的，精读 3-5 篇，把它的 outline 搞清楚，你就胸有成竹了。我打开 JBC 网站一看，呵呵，每期专门有 Gene Regulation 板块。根据 JBC 上面的文章，A 调控 B 基因，很多都是通过第三者如转录因子实现的。我再翻出以前自己的 Real-time PCR 实验结果，发现过表达 A 基因后，转录因子 C 的 mRNA 水平显著增加，而干扰 A 基因表达，转录因子 C 的 mRNA 水平显著降低。目前这个现象还没有文献报道。后期，我准备
15、通过 Luciferase reporter assay 和CHIP assay 来验证转录因子 C 是否能与 B 基因作用。我想请教的问题是：A 基因调控转录因子 C，除了前期的 Real-time PCR 实验（当然再补一个 Western Blot 实验） ，我还需要做其他实验吗？会不会审稿人再提出：你需要弄清楚 A 基因如何调控转录因子 C 才行。说简单点：A 基因通过转录因子 C 调控基因 B，是否要将 A 影响 C， C 影响 B 两步都弄清楚？看你的目标杂志了，如果是 JBC 这样偏机制的，估计会要你说清楚的3、 A 可以影响 B 的 mRNA 水平，也能影响 B 的蛋白水平，这样的话，可能是只通过影响 B的 RNA 水平影响 B 的蛋白表达，也可能同时影响 B 的 RNA 水平和 B 的蛋白稳定性。B 的蛋白稳定性你可以通过加入 CHX 检测 B 的半衰期。另外就是你说的 Luciferase reporter assay实验。4、 A 和 B 的变化总是一致的，应该很有可能是通过转录水平调控的，因为你的 mRNA、蛋白都变了。既然是转录水平，那就要找到 B 的启动子的序列，对应和这个序列结合的蛋白，这个蛋白可能是 A 也可能是其他的间接的。
