1、第三章 免疫原和抗血清的制备第一节 免疫原的制备第二节 免疫佐剂第三节 抗血清的制备第四节 抗血清的鉴定和保存第五节 抗血清的纯化第一节 免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。免疫原相当于抗原。一、颗粒性抗原的制备颗粒性抗原：各种细胞、细菌、寄生虫。1.细胞抗原（如绵羊红细胞） 一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。2.细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。二、可溶性抗原的制备和纯化（一）可溶性抗原的制备蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、
2、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原，免疫前常需提取和纯化。1.组织细胞抗原的制备细胞破碎方法有：（1）高速组织捣碎机法。（2）研磨法，可用组织匀浆器或乳钵。2.组织细胞或培养细胞可溶性抗原制备第一步 单个细胞获得的方法（1）机械捣碎（2）酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶第二步 细胞破碎方法有：（1）反复冻融法（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法，常用溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶（5）表面活性剂处理法3.免疫球蛋白片段的制备五种免疫球蛋白都具抗原性，皆可提取及纯化，但如分解成片段（如 Fab 片段、Fc 片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。（1）非共价键解离法（2
3、）共价键解离法（3）溴化氰裂解法（4）酶解法1）木瓜酶可将 IgG 裂解成 2 个 Fab 片段及 1 个 Fc 片段。2）胃蛋白酶可将 IgG 裂解成 F（ab）2 片段及数个小片段。3）胰蛋白酶可将 IgG 切成不规则的肽链。（二）可溶性抗原的纯化1.超速离心法 仅适用于少数大分子抗原及一些比重较轻的抗原，而不适用于大多数中小分子抗原。2.选择性沉淀法（1）核酸去除法 可采用氯化锰、硫酸提取鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂。核糖核酸降解法更简便（采用 DNA 或 RNA 酶）。（2）盐析法 常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。（3）有机溶剂沉淀法 常采用乙醇或丙酮。（4）聚合
4、物沉淀法 常用非离子型聚合物，如分子量为 20006000 的聚乙二醇（PEG）。3.凝胶过滤法又叫分子筛层析。通过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开，选择凝胶柱时应注意选用适于分离范围内的凝胶。4.离子交换层析法 离子交换层析是利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原常用的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂。5.亲和层析法亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体、DNA 和 RNA 等之间有特殊亲和力，一定条件下，两者可紧密结合成复合物，如将复合物的一方固定于固相载体
5、上，则可从溶液中分离和提纯另一方。（1）亲和层析支持物的选择常用的有琼脂糖珠（sepharose2B、4B、6B）、琼脂糖、聚丙乙烯酰胺、多孔玻璃球等。（2）抗原或抗体与支持物的结合载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法。6.电泳法（三）纯化抗原的鉴定1.蛋白含量测定 采用紫外光吸收法、双缩脲法、酚试剂法等,常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm 和 260nm 的吸光度值，并根据公式计算蛋白含量。2.分子量测定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法、凝胶过滤法等。3.纯度鉴定 采用醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法。4.免疫活性鉴定 采用双向免疫
6、扩散法、免疫电泳法或 ELISA 法等。三、半抗原性免疫原的制备半抗原指某物质在独立存在时只具有抗原性而无免疫原性，这些物质称为半抗原半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。（一）载体1.蛋白质类 以牛血白蛋白最常用。2.多肽聚合物 常用多聚赖氨酸。3.大分子聚合物和某些颗粒 聚乙烯吡咯烷酮、药用炭、羧甲基纤维素等皆常用。（二）半抗原与载体的连接方法1.物理方法物理方法是用通过电荷和微孔吸附半抗原，吸附的载体有淀粉、聚乙烯毗咯烷酮、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素。2.化学方法化学方法是利用某些功能基团将半抗原连接到载体上（三）半抗原性免疫原的鉴定1.吸收光谱分析法2.放射性核素标记半抗原
7、渗入法第二节 免疫佐剂一、佐剂的种类（一）化合物 包括氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂（羊毛脂与液状石蜡的混合物）以及人工合成的多聚肌苷酸：胞苷酸、脂质体等。（二）生物制剂1.经处理改造的细菌及其代谢产物，如卡介苗。2.细胞因子及热休克蛋白最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂加卡介苗）和弗氏不完全佐剂两种。使用时加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原与佐剂形成油包水乳剂。佐剂和抗原的比例为 1：1。乳化的方法有两种：研磨法 搅拌混合法。二、佐剂的作用机制（一）改变抗原的物理性状，延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺激免疫系统。（二）刺激单核-吞噬
8、细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。（三）刺激淋巴细胞增殖和分化免疫佐剂：与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的辅助物质。第三节 抗血清的制备一、抗血清的概念含有抗体的血清，就是抗血清。将免疫原接种给动物，该动物在抗原刺激下，体内多个 B 细胞激活并产生针对某一抗原的抗体，其混合物为多克隆抗体。采集动物血液，分离血清，即得到抗血清。二、免疫动物的选择能用于制备抗血清的动物主要是哺乳类和禽类，常用的有家兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。（一）抗原来源与动物种属的关系 抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。（二）动物个体的选择 动物个体必须适龄、健康、体重
9、合适。抗体需求量大时，可选用马、绵羊等大动物。抗血清需求量少时，可选用家兔、豚鼠和鸡等小动物。（三）抗血清的分为 R 型和 H 型R 型抗血清是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较宽，适于作诊断试剂。H 型抗血清是用马等大动物免疫获得的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般用作免疫治疗。（四）抗原的性质对于蛋白质抗原大部分动物皆适合，常用的是山羊和家兔。在某些动物体内有类似物质时，蛋白质抗原对这些动物免疫原性极差，如 IgE 对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类对山羊，免疫后均不易产生抗体。三、免疫程序（一）免疫原的剂量免疫原剂量过大或过小都可使动物产生免疫耐受，在一定剂量范
10、围内，免疫原剂量越大，产生的抗体效价越高。（二）免疫途径有皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、淋巴结等途径皮内或皮下免疫时一般采用多点注射初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射。宝贵抗原可选择淋巴结内微量注射法。（三）免疫间隔时间首次免疫后，因机体正处于识别抗原和进行 B 细胞活化增殖阶段，如果很快进行第 2 次注入抗原，极易造成免疫抑制。若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高，第 1 次与第 2 次免疫间隔时间以 1020 天为好，第3 次及以后的间隔一般为 710 天。四、动物采血法（一）颈动脉采血法 最常用（二）心脏采血法（三）静脉采血法五、血清收集动物采血后，应尽快
11、分离血清，分离血清的方法常采用室温自然凝固，然后置 37或 4使血块收缩后，收集血清。第四节 抗血清的鉴定和保存一、抗血清的鉴定（一）抗体特异性的鉴定 常用双向免疫扩散法观察沉淀线若粗抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线，且两者互相融合，则证明该动物已产生单价特异性抗体。若纯化抗原出现一条，而粗抗原出现多条线，且其中一条沉淀线与纯抗原沉淀线相连接，也是成功的免疫。若不出现沉淀线，表示免疫失败。（二）抗体效价的测定颗粒性抗原采用凝集试验。可溶性抗原采用双向免疫扩散试验、ELISA。测定抗体效价有两种稀释方法：一种是将经过系列稀释的抗血清分别与一个浓度的抗原反应。另一种是同时稀释抗原和抗血清，分别与不
12、同浓度的抗血清进行双向免疫扩散试验（称为棋盘滴定）。（三）抗体纯度的测定采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、双向免疫扩散试验、免疫电泳等方法。若只出现一条蛋白电泳区带说明抗体纯化已达到要求。若出现多条蛋白区带则表明抗血清中混有杂蛋白，须进一步纯化。（四）抗体亲和力的测定二、抗血清的保存（一）28保存：用于短期保存（二）冷冻保存：是常用的抗体保存方法将抗体分为小包装，在-80-20保存，一般可保存 5 年，效价不会明显下降，但应避免反复冻融。（三）真空干燥保存：用真空冻干机进行干燥，封装后可长期保存，一般在冰箱中可保存 510 年。第五节 抗血清的纯化抗原免疫动物制备的抗血清是成
13、分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分最常见的是提取抗血清中的特异性 IgG 或单价抗体。一、特异性 IgG 抗体1.盐析法 多采用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法2.凝胶过滤法血清蛋白的分级分离常用凝胶过滤法，按分子大小可分为 3 组：第 1 组包括 IgM 和一些脂蛋白；第 2组主要是 IgG 和较少量的 IgA、IgD、IgE 等；第 3 组主要是白蛋白、血清黏蛋白、转铁蛋白等。3.离子交换层析法4.亲和层析法二、单价特异性抗血清单价特异性是指血清只与其特异性抗原发生反应。免疫得到的抗血清总是有抗白蛋白等杂抗体存在。杂抗体的去除有两种方法：1.亲和层析法2.吸附剂方法
