1、ICS65.020.20 B31备 案 号 ： 37035-2013 DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 2258-2012苏粉 13 号番茄种子纯度 SRAP 分子标记鉴定方法Rules for identification purity of tomato sufen No13 using SRAP molecular markers2012-12-28 发布 2013-02-28 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB32/T 2258-2012前 言苏 粉 13号 番 茄 是 江 苏 省 农 科 院 蔬 菜 所 最 新 育 成 的 高 抗 番 茄 黄 化
2、曲 叶 病 毒 病 的 杂 种 一 代 。 本 标 准 按 GB/T1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 的 规 定 编 写 。 本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：赵丽萍、赵统敏、余文贵、杨玛丽。DB32/T 2258-20121苏 粉 13 号 番 茄 种 子 纯 度 SRAP 分 子 标 记 鉴 定 方 法1 范围本 标 准 规 定 了 苏 粉 13 号 及 其 亲 本 的 品 种 纯 度 SRAP 分 子 标 记 鉴 定 方 法 。 本 标 准 适 用 于 苏 粉 13 号 及 其
3、 亲 本 的 品 种 纯 度 鉴 定 。2 规 范 性 引 用 文 件下列文件对于本文件的应用是必不可少的， 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2-1995 农 作 物 种 子 检 验 规 程 扦样GB/T 3543.5-1995 农 作 物 种 子 检 验 规 程 真 实 性 和 品 种 纯 度 鉴 定 GB 16715.3 瓜 菜 作 物 种 子 茄果类3 术 语 、 定 义 和 缩 略 词下列术语和定义适用于本标准。3.1SRAP sequence-related amplifie
4、d polymorphism即 相 关 序 列 扩 增 多 态 性 ， 又 叫 基 于 序 列 扩 增 多 态 性 ， 是 基 于 PCR 的标记系统。该标记通过 17 个碱 基 的 正 向 引 物 和 18 个 碱 基 的 反 向 引 物 对 开 放 读 码 框 (oRFs)进 行 扩 增 。3.2品种纯度示。3.3品种在 DNA 分子标记 条带方面典型一致的程度， 用本品种的种子数占供检测样品种子数的百分率表引物结合在模板DNA 上 的 互 补 短 链 ， 提 供 3 -OH 末 端 作 为 DNA 合 成 的 起 点 ， 延 伸 合 成 模 板 DNA 的 互 补 链。3.4内含子列。3
5、.5真核生物细胞 DNA 中的间隔序列即为内含子，是存在于真核生物基因中无编码意义而被切除的序启动子是一段位于结构基因 5 端 上 游 区 的 DNA 序 列 ， 能 活 化 RNA 聚 合 酶 ， 使 之 与 模 板 DNA 准确地相结合DB32/T 2258-20122并具有转录起始的特异性。3.6 缩略词下列缩略词适用于本标准。SRAP 相 关 序 列 扩 增 多 态 性 (sequence-related amplified polymorphism) PCR 聚 合 酶 链 式 反 应 （ Polymerase Chain Reaction)DNA 脱 氧 核 糖 核 酸 （ Deo
6、xyribonucleic Acid)TBE 三 羟 基 氨 基 甲 烷 -硼 酸 一 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 （ Tris Boric-acid EDTA)4 原理SRAP标记均 匀分布于番茄基因组中， 该标记的正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大 的内含子、 启动子和间隔序列 ， 而由于内含子、 启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大 ， 从 而 扩 增 出 SRAP多 态 性 标 记 。 不 同 番 茄 品 种 由 于 遗 传 结 构 的 差 异 ， 经 过 一 对 或 多 对 引 物 进 行 PCR扩 增 后 会形成不同分子量大小的扩增产物，经染色形成不同番
7、茄品种的电泳图谱，鉴定番茄品种纯度。5 仪 器 设 备 及 试 剂5.1 仪 器 设 备PCR 扩增仪； 电泳槽； 电泳仪； 电子天平 （感量0.0 1g， 0.001g） ； 冰箱； 微量加样器 （10l ， 100 l， 200 l， 1000 l） ； 恒 温 水 浴 锅 （ 0 -100 ） ， 高 速 冷 冻 离 心 机 ； 磁 力 搅 拌 器 ； 高 压 灭 菌 锅 ； 数 码 照 相机等。烧 杯 ； 容 量 瓶 （ 500ml， 1000ml） ； 离 心 管 （ 0.2ml， 0.5ml， 1.5ml， 2ml） ； 吸 头 (10 l， 200 l， 1000 l)； 注 射
8、 器 （ 100ml） ； 96 孔 PCR 板 ； 离 心 管 架 ； 染 色 盒 等 。5.2 试剂乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 （ EDTA-Na2） ； 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris） ； 盐 酸 （ HCl， 36%） ； 氢 氧 化 钠 (NaOH)； 10 倍 PCR 缓 冲 液 （不含Mg 2+） ； 液氮； 三 氯甲烷； 异戊醇； 氯化镁 （Mg Cl ） ； 四种 脱氧核糖核苷酸 （dNT P ） ；2 sTaqDNA 聚 合 酶 （ 5U/ l） ； SRAP 引 物 ； 矿 物 油 ； 溴 酚 蓝 ； 蔗 糖 ； 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 ； 丙 烯
9、 酰 胺 ； 硼 酸 ； 无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；硫代硫酸钠；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液等。各种试剂配制见附录A 。6 引物筛选适 宜 引 物 应 为 扩 增 后 的 苏 粉 13号 番 茄 SRAP电 泳 条 带 含 有 双 亲 条 带 ， 而 且 带 型 清 晰 、 重 复 性 好 。 取 苏 粉 13号 种 子 5粒 及 父 母 本 种 子 各 2粒 ， 利 用 一 系 列 引 物 进 行 分 析 ， 从 中 确 定 适 宜 的 引 物 。7 方法步骤7.1 样 品 制 备从供检 样品中随机取苏粉13号 番茄种子200粒， 播于穴盘中， 待种子长出真叶时， 随机选100株取叶 片
10、提取DNA。7.2 DNA 提 取取幼嫩叶片放入1.5ml离 心管中； 加液氮， 用事先准备好的枪头进行捣碎研磨； 然后迅速加入500 l 提 取 液 ， 并 在 涡 旋 仪 上 涡 旋 混 匀 ； 放 入 水 浴 锅 ， 30min左 右 ， 每 隔 5min上 下 颠 倒 摇 匀 ； 之 后 加 入 跟 提 取 液 等 体 积 的 氯 仿 /异 戊 醇 ， 上 下 颠 倒 混 匀 ， 再 静 置 3min左 右 ； 离 心 10min， 12000r/min； 提 取 上 清 液 （ 枪 头 孔 要 剪 大 ） 再 加 冰 冻 过 的 等 体 积 异 丙 醇 ， 出 现 白 色 絮 状 沉
11、 淀 ； 再 冰 冻 10-30min， 再 离 心 ， 之 后 倒 掉 上DB32/T 2258-20123清 液 ， 底 部 即 是 DNA， 用 75%的 乙 醇 洗 涤 2次 ， 吹 干 ， 加 入 200 l灭 菌 ddH2O。 样 品 DNA 溶 液 可 以 直 接 进 行 PCR 扩 增 或 在 -20 下 保 存 。7.3 扩增SRAP-PCR(10 l)反 应 体 系 ： l x Buffer， 引 物 各 0.3 mol L-1， dNTPs0.2mmolL-1， Mg2+3.0mmolL-1， o.6U Taq DNA polymerase， 20ng模 板 DNA。PC
12、R扩 增 反 应 程 序 ： 94 3 min；94 1 min， 35 l min， 72 1.5min， 5个 循 环 ； 94 l min， 50 l min，72 l.5 min， 33个 循 环 ； 72 7 min延 伸 ； 扩 增 产 物 在 4 保 存 。7.4 检测7.4.1 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 制 作将 玻 璃 板 洗 净 ， 晾 干 后 装 玻 璃 板 于 胶 条 上 ， 取 30% Arc:Bis11.97ml， 5TBE 9ml， ddH2O 23.4ml， 加入 36l TEMED 和 540l 10%AP 溶 液 ， 轻 轻 摇 匀 。 将 凝
13、 胶 溶 液 均 匀 倒 入 两 块 玻 璃 板 中 间 ， 将 梳 子 垂 直 插 入 胶 中 （ 注 意 防 止 灌 胶 过 程 中 产 生 气 泡 ） ， 使 其 聚 合 1h 以 上 ， 让 其 充 分 凝 固 。7.4.2 预 电 泳拔 下 梳 子 ， 倒 入 1TBE 缓 冲 液 ， 90V 稳 压 下 预 电 泳 30-60min。7.4.3 点样扩增产物加 3l 溴 酚 蓝 加 样 缓 冲 液 ， 混 匀 ， 每 加 样 孔 点 样 量 4l。7.4.4 电泳120V 稳 压 下 电 泳 2h。7.4.5 染色电泳完毕后将玻璃板从电泳槽中取出，剥下凝胶；将凝胶放入固定液中固定
14、15-20min，用蒸馏水 漂洗 2 次，每次约 1min；然后将凝胶放入染色液中染色 15-20min， 用 蒸 馏 水 快 速 漂 洗 2 次，每次不超 过 10s； 然 后 将 凝 胶 放 入 显 色 液 中 ， 轻 轻 晃 动 ， 待 条 带 清 晰 后 ， 用 蒸 馏 水 漂 洗 2 次 ， 放 在 灯 箱 上 记 录 结 果，拍照保存。8 数 据 统 计 与 计 算如 果 苏 粉 13 号 SRAP 位 点 表 现 双 亲 带 型 ， 说 明 品 种 纯 合 ； 如 果 出 现 单 个 亲 本 带 型 或 其 他 带 型 ， 认 为 该 种 子 为 假 杂 种 。 品 种 纯 度
15、（ P） 的 数 值 以 %表 示 ， 按 公 式 （ 1） 计 算 ：P =NrN2/N1100% .（ 1）式中： P品种纯度； Nr N1检测种子数；N2非双亲带型种子数。9 鉴定报告苏粉 13 号 番 茄 纯 度 鉴 定 报 告 见 表 1。DB32/T 2258-20124表 1 年 苏 粉 13 号 番 茄 SRAP 标 记 纯 度 鉴 定 表品种名称 检测种子数 非双亲带型种子数 品种纯度 %取样日期：鉴定地点：鉴定日期：鉴定技术负责人（签字）：DB32/T 2258-20125附 录 A（资料附录） 主要试剂配制A.1 10 mol/L 氢 氧 化 钠 （ NaOH） 溶 液
16、： 取 NaOH 80g， 先 用 160ml ddH2O溶 解 后 ， 定 容 至 200ml。A.2 0.5 mol/L EDTA（ pH 8.0） ： 取 EDTA-Na2 186.1g倒 入 1000ml烧 杯 中 ， 加 入 800ml ddH2O溶 解 ， 用 固 体 氢 氧 化 钠 调 节 pH至 8.0， 定 容 至 1000ml， 高 压 灭 菌 。A.3 1mol/L Tris-HCl（p H 8.0） ： 取三羟甲基氨基甲烷(T ris) 60.55g倒入 500ml烧杯中， 加 入40 0ml ddH2O 溶 解 ， 用 盐 酸 (HCl)调 pH至 8.0， 定 容
17、至 500ml， 高 压 灭 菌 。A.4 TE缓 冲 液 （ pH 2.0） ： 取 1mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 5ml和 0.5mol/L EDTA（ pH 8.0） 1ml， 用 盐 酸 (HCl)调 pH至 2.0， 加 ddH2O定 容 至 500ml， 高 压 灭 菌 。A.5 CTAB 提 取液： 称取氯 化钠 （N aCl） 40.9g， 倒 入 500ml 烧 杯 中 ， 加 200ml ddH2O 溶 解 ， 加 1mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 50ml，加 0.5mol/L E DTA（ pH 8.0） 2 0ml， 加 十 六 烷 基
18、 三 甲 基 溴 化 铵 （ CTAB） 10g， 加 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 （ PVP） 5g， 用 ddH2O 定 容 至 500ml。 4 条 件 保 存 ， 用 前 加 -巯 基 乙 醇 （ -Me） 5ml。 A.6 SRAP引 物 ： 用 灭 菌 ddH2O分 别 配 制 正 向 引 物 （ F） 和 反 向 引 物 （ R） 终 浓 度 均 为 100mol/L的 储 存 液 ， 取 10l储 存 液 加 入 490l灭 菌 ddH2O配 成 2mol/L工 作 液 。A.7 三 氯 甲 烷 /异 戊 醇 （ 24:1） ： 取 2400ml三 氯 甲 烷 和 100ml异
19、 戊 醇 ， 混 匀 。A.8 加 样 缓 冲 液 ： 取 0.25g溴 酚 蓝 和 40g蔗 糖 ， 倒 入 200ml烧 杯 中 ， 用 ddH2O定 容 至 100ml。A.9 50TBE缓冲液： 称 取三羟甲基氨基甲烷 （T ris） 54g ， 硼 酸 2 7.5g， 倒 入10 00ml烧 杯中， 加入80 0ml 蒸馏水溶解，再加入0.5 mol/L EDTA（pH 8 .0） 20ml， 定 容 至 1000ml。A.10 1TBE缓 冲 液 ： 取 100ml 50TBE缓 冲 液 ， 加 蒸 馏 水 4500ml， 混 匀 。A.11 30% Arc:Bis：取 10g 甲
20、 叉 双 丙 烯 酰 胺 （ Bis） 溶 于 600ml ddH2O 中 ， 搅 拌 至 溶 解 后 ， 加 入 290g 丙 烯 酰 胺 （ Arc） ， 搅 拌 至 溶 解 ， 定 容 至 1L， 4 保 存 。A.12 10 过 硫 酸 铵 （ 10%AP） ： 取 1g过 硫 酸 铵 ， 加 10mlddH2O溶 解 ， 4 下 保 存 （ 保 存 期 不 超 过 7d） 。A.13 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 （ 10mg/ml） ： 取 1g硫 代 硫 酸 钠 ， 加 100ml ddH2O溶解。A.14 固 定 液取 20ml 100%乙 醇 ， 1ml 冰 醋 酸 ， 加 蒸 馏 水 定 容 至 200 ml。A.15 染 色 液取硝酸银 2 g ， 加 蒸 馏 水 定 容 至 200 ml。A.16 显 色 液取氢氧化钠 3g，加 200ml 蒸 馏 水 溶 解 ， 再 加 甲 醛 2ml 和 50l 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 ， 加 蒸 馏 水 定 容 至 200ml 。
