1、ICS 65.020.30B 40备 案号 ： DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 18242011禽肉肌纤维特性的测定 石蜡切片法Determination of poultry muscle fiber characteristicParaffin section method2011-06-15 发布 2011-08-15 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T 18242011I前 言本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1部 分 ： 标 准 的 结 构 与 编 写 的 规 定 编 写 。 本标准由江苏省家禽科学研究所提出。 本 标
2、准 起 草 单 位 ： 江 苏 省 家 禽 科 学 研 究 所 、 农 业 部 家 禽 品 质 监 督 检 验 测 试 中 心 （ 扬 州 ） 、 扬 州 翔 龙禽业发展有限公司。本标准主要起草人： 唐修君、高玉时、王克华、葛庆联、陆俊贤、施祖灏、张小燕、蒲俊华。DB32/T 182420111禽肉肌纤维特性的测定 石蜡切片法1 范 围本 标 准 规 定 了 石 蜡 切 片 法 测 定 禽 肉 肌 纤 维 特 性 的 术 语 和 定 义 、 试 剂 与 配 制 、 仪 器 和 设备 、 样 品 处 理、 切片制作、读片与计算、数据纪录和允许差。本标准适用于石蜡切片法测定禽类肌纤维密度、直径、间
3、距、肌束间距以及肌大束间距。2 规范性引用文件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 部 分 。 凡 是不 注日 期的 引用 文件 ，其 最新 版本 （包 括所 有的 修改 单） 适用 于本 部分 。GB/T 6682 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1肌纤维密度 Muscle fiber density同 一肌 束内 ，单 位面 积肌 纤维 根数 。3.2肌纤维直径 Muscle fiber diamet
4、er肌纤维长径与短径的几何平均数。3.3肌纤维间距 Muscle fiber gap同一肌束内，相邻肌纤维之间的垂直距离。3.4肌 束 间 距 Muscle bundle gap同一肌大束内，相邻肌束之间的垂直距离。3.5肌大束间距 Distance between muscle bundles相邻肌大束之间的垂直距离。4 试剂与配制DB32/T 182420112除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，用水符合 GB /T 6682 一级水的规定。4.1 4%甲醛溶液1 体积甲醛与 9 体 积 水 混 匀 。4.2 无 水 乙 醇4.3 75%酒精7.5 体 积无 水乙 醇与 2.5 体 积水
5、 混匀 ； 85%酒 精： 8.5 体 积无 水乙 醇与 1.5 体 积水 混匀 ； 95%酒 精： 9.5体积无水乙醇与 0.5 体 积 水 混 匀 。4.4 二甲苯4.5 石 蜡65反复提炼，直至蜡的颜色泛黄可用。4.6 苏木素4.7 1%盐酸酒精1 体积盐酸与 99 体积无水乙醇混匀。4.8 0.5%伊红酒精称 取 0.5g 伊 红 ， 用 100mL 无水乙醇溶解。4.9 中 性 树 脂5 仪器和设备5.1 组织切片机切 片 厚 度 5m1000m。5.2 烘 箱精度1。5.3 恒温水浴锅精度1。5.4 包埋框5.5 镊 子使 用 之 前 放 入 60烘箱中预热。5.6 载玻片和盖玻片
6、用洗液浸泡 24h 后 用 自 来 水 充 分 洗 涤 ， 再 用 95%酒精浸泡后用软绸布或纱布擦干，待用。5.7 光学显微镜3DB32/T 18242011放 大 倍 数 104 至 1040。6 样 品处 理6.1 取样与固定家禽宰杀放血后，在 30min 内顺着肌纤维方向取样，胸肌取样部位为胸大肌前端 1/3、距龙骨 2cm 处 ， 腿 肌 取 样 部 位 为 大 腿 肌 中 部 ， 距 股 骨 1cm 处 ， 取 样 大 小 为 长 宽 高 约 2cm1 cm1 cm。 剔 除 肌 肉 表 面 筋 、 腱 、 膜 及 脂 肪 ， 随 即 置 于 4%甲醛溶液中固定 10h，取出修成
7、0.7cm0.6 cm0.4cm 大小的 组 织 块 ， 重 新 置 于 4%甲醛溶液中继续固定 12 h。6.2 洗 涤将组织样置于流动的自来水下，浸泡 10h15h。6.3 脱 水采用不同浓度的酒精对组织样进行梯度脱水，脱水步骤、酒精浓度和各步骤所需时间见表 1。表 1 脱 水 步 骤 、 酒 精 浓 度 和 各 步 骤 所 需 时 间步骤 酒精浓度 时间一 75% 2h4h二 85% 2h4h三 95% 2h4h四 无水乙醇 2h3h五 无水乙醇 2h3h6.4 透 明将组织放进二甲苯中浸泡 10min 15min， 至 组 织 呈 半 透 明 或 透 明 状 态 ， 用 肉 眼 可 观
8、 察 到 透 明 感 时 立即取出。6.5 浸蜡和换蜡6.5.1 浸蜡：将透明好的组织块完全置于 60石蜡中浸泡 2h。6.5.2 换蜡：将蜡块取出立即另置于 60新蜡中再浸泡 2h 左右。6.6 包埋和修块将 熔 化 的 石 蜡 倒 入 包 埋框 ， 待 蜡 将 近 凝 固 之 前 ， 用 镊 子 将 组 织 块 放 至 包 埋框 接 近 底 部 的 位 置 ， 使肌 纤 维 长 轴与 待 切 面 垂 直 ， 将 准 备 好 的 标 签 放 在 待 凝 固 的 蜡 上 面 ， 完 全 自 然 冷 却 后 ， 切 去 余 蜡 部 分 ， 根 据 需要适当修整蜡块，一般修成方形或梯形。7 切 片
9、制 作7.1 切片、展片和贴片、烤片7.1.1 切 片 ： 使 用 组 织 切 片 机 切 片 ， 切 片 厚 度 宜 为 7m， 前 15 张切片一般不用。7.1.2 展 片 和 贴 片 ： 将 切 好 的 蜡 片 轻 轻 平 铺 于 10-20 水中展片，用载玻片从切片下面轻轻捞起，立4DB32/T 182420111 1 2 2 3 3 n n1n即置于 40 恒温水浴锅中贴片，切片和载玻片之间不应有气泡。7.1.3 烤 片 ： 将 粘 有 切 片 的 载 玻 片 置 于 60烘箱内烤片 24h。7.2 染 色切片烤片后采用二甲苯两次脱蜡、梯度酒精洗二甲苯，之后进行苏木素 -伊红（ HE
10、）染色。各步骤 名 称、 所需 试剂 和时 间见 表 2表 2 切片染色各步骤名称、所需试剂和时间步骤 名称 试剂 时间一 脱蜡 二甲苯 10min二 再脱蜡 二甲苯 10min三 洗 二 甲 苯 （ ） 95%乙 醇 1min四 洗 二 甲 苯 （ ） 85%乙 醇 1min五 洗 二 甲 苯 （ ） 75%乙 醇 1min六 洗酒精 自来水 1min七 染色 苏木素 10-20min八 水洗 自来水 至切片呈淡蓝色九 分化 1%盐 酸 酒 精 1s十 水洗 自来水 返蓝即可十一 染色 0.5%伊 红 酒 精 20s十二 水洗 自来水 多次水洗，至切片红色变淡7.3 封 片如 需 长 期 保
11、 存 切 片 ， 则 应 进 行 封 片 。 切 片 晾 干 后 ， 使 用 中 性 树 脂 封 片 ， 中 性 树 脂 的 量 以 封 片 后能完 全盖住切片为宜，封片过程中不应有气泡。8 读片与计算8.1 肌纤维密度随机取 3张切片，每张切片取 3个或 3个以上视野，在 1010倍显微镜下读出每个视野肌纤维根数， 求加权平均数，按公式（1）计算。式中：X=（X /Y X /Y X /Y X /Y ）10 6/ N（1）X肉样肌纤维密度，单位为根每平方毫米（根/ mm2） ； X 1n每个视野中肌纤维根数，单位为根；Y 每个视野面积，单位为平方微米（u m2） ； N视野数（大于或等于9 ）
12、 。8.2 肌纤维直径随机取 3张切片，每张切片取 3个视野，每个视野取 10根或 10根以上肌纤维，在 1040倍显微镜下， 测量每根肌纤维长径和短径距离，算出几何平均值，再求加权平均数，按公式（2）计算。X=（X 1Y 1）/2 （X 2Y 2）/2（X 3Y 3）/2 （X nY n）/2/ N（2）5DB32/T 18242011式中： X 肉样肌纤维直径，单位为微米（ m） ； X1n肌纤维长轴距离，单位为微米（ m） ； Y1n肌纤维短轴距离，单位为微米（ m） ； N肌纤维根数（大于或等于9 0） 。8.3 肌纤维间距随机取 3张切片，每张切片取 3个视野，每个视野测量 10个或 10个以上间距，在 1040倍显微镜下， 测 量每 个间 距 离， 求加 权平 均数， 按公 式（ 3） 计算 。X=（X 1X 2X 3X n）/ N（3）式中： X 肉样肌纤维间距、肌束间距或肌大束间距，单位为微米（ m） ； X1n每个肌纤维间距、肌束间距或肌大束间距，单位为微米（ m） ； N间距数（大于或等于9 0） 。8.4 肌 束 间 距按8.3执行。8.5 肌大束间距按8.3执行。9 数 据记 录记录数据时应仔细填写所取肉样种类、取样部位及检测数据，计算结果保留两位有效数字。10 允许差同一肉样，有效区域的测定值允许的相对偏差应15%。
