1、第八章 微生物遗传与变异,遗传:,亲代与子代相似.,变异:,亲代与子代、子代间不同个体不完 全相同.,遗传(inheritance)和变异(variation)是 生命的最本质特性之一,遗传型:,表型(表现型):,生物的全部遗传因子及基因,具有一定遗传型的个体, 在特定环境条件下通过 生长发育所表现出的形 态等生物学特征的总和.,表型是由遗传型所决定,但也和环境有关。,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单,营养体一般为单倍体，方便建立纯系。,很多常见微生物都易于人工培养,快速、大量生长繁殖。,对环境因素的作用敏感,易于获得各类突变株，操作性强。,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要
2、的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。 对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,第一节 遗传的物质基础,一、DNA作为遗传物质,二、RNA作为遗传物质,三、朊病毒的发现与思考,一、 DNA作为遗传物质,（一）经典转化实验（transformation）：1928,F.Griffith， 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌） SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性 RII
3、型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性,1928年，Griffith进行了以下几组实验： （1）动物实验 对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活 对小鼠注射活SIII菌小鼠死亡 对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 小鼠死亡 抽取心血分离 活的SIII菌,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。,热死SIII菌不生长 活 RII 菌长出RII菌 热死SIII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长
4、出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,（二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放
5、射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。,二、RNA作为遗传物质,MTV HRV,HRV MTV,用两种杂合病毒感染寄主： （1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 （2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。,三、朊病毒的发现与思考,亚病毒的一种:具有传染性
6、的蛋白质致 病因子,迄今为止尚为发现该蛋白内含 有核酸。,其致病作用是因动物体内正常的蛋白 质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致,而 这二种蛋白质的一级结构并没有改变.,1）蛋白质是否可以作为遗传物质？prion是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？,2）蛋白质折叠与功能的关系,是否存在折叠密码？,第二节 微生物的遗传物质,一、概念,基因组（genome）: 一个物种的单倍体的所有染色体及其 所包含的遗传信息的总称.,原核生物(如细菌),多为单倍体(在一般 情况下只有一条染色体)真核微生物,多 条染色体,例如啤酒酵母有16条染色体. 有时为双倍体,二、微生物基因组结构的特点,1
7、、原核生物(细菌、古生菌)的基因组,1)染色体为双链环状的DNA分子(单倍体);,链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中,该小体称为拟核(nucliod),其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子,使其压缩成一种手脚架形的致密结构。,1)染色体为双链环状的DNA分子(单倍体);,2)基因组上遗传信息具有连续性;,基因数基本接近由它的基因组大小所 估计的基因数,参见表8-1(通常以1000bp1500bp为一个基因进行计算),微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA;用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等信号序列。,一般不含内含子
8、,遗传信息是连续的而 不是中断的。,个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌) 和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有 内含子或间插序列,1)染色体为双链环状的DNA分子(单倍体);,2)基因组上遗传信息具有连续性;,3)功能相关的结构基因组成操纵子结构;,4)结构基因的单拷贝,rRNA基因的多拷贝;,5)基因组的重复序列少而短.,古生菌的基因组在结构上类似于细菌.但 是信息传递系统(复制、转录和翻译)则与 细菌不同而类似于真核生物。,操纵子(operon): 功能相关的几个基因前后相连,再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子、操作子等）在基因转录时协同动作。,2、真核微生物（啤酒酵母
9、）的基因组,1）典型的真核染色体结构；,2）没有明显的操纵子结构；,啤酒酵母基因组大小为13.5106bp， 分布在16条染色体中。,3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；,4）重复序列多；,三、 质粒和转座因子,质粒（plasmid）：,一种独立于染色体外,能进行自主复制的细胞质遗传因子,主要存在于各种微生物细胞中。,转座因子（transposable element）：,位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列,广泛分布于原核和真核细胞中。,质粒和转座因子是细胞中除染色体以外 的另外二类遗传因子,一）、质粒的分子结构,1、结构,通常以共价闭合环状(covalently clos
10、edcircle,简称CCC)的超螺旋双链DNA分 子存在于细胞中,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb（细菌质粒多在10kb以内）,有三种结构类型,CCC、开环和线型,2、质粒的类型,严谨型质粒(stringent plasmid)： 复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxed plasmid)： 复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,二）、质粒的主要类型,在某些特殊条件下,质粒有时能赋予宿 主细胞以特殊的机能,从而使宿主得到 生长优势。,质粒所含的基因对宿主细胞一般是非 必需的；,质粒所编 码的功能 和赋予宿 主的表型 效应,致育因子(Fertility
11、factor,F因子) 抗性因子(Resistance factor,R因子) 产细菌素的质粒(Bacteriocin production plasmid) 毒性质粒(virulence plasmid) 代谢质粒(Metabolic plasmid) 隐秘质粒(cryptic plasmid),1、致育因子(Fertility factor，F因子),又称F质粒,其大小约100kb,这是最早发 现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接 合作用)有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株 (相当于雄性),无F质粒的菌株 称为F-菌株(相当于雌性).,F因子能以游离状态 (F+)和以与染色体相 结
12、合的状态(Hfr)存在 于细胞中,所以又称之 为附加体(episome)。,2、抗性因子(Resistance factor,R因子),包括抗药性和抗重金属二大类,简称R质粒。,抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为11106Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。,3、产细菌素的质粒 （Bacterio
13、cin production plasmid）,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：,大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素）， 而质粒被称为Col质粒。,由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。,4、毒性质粒（virulence plasmid）,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的,这些质粒具有编码毒素的基因,其产物对宿主(动物、植物)造成伤害。,产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要
14、病原菌之一,其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。,苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中) 的质粒,根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶 植物冠瘿瘤的致病因子,Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到 植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体,5、代谢质粒（Metabolic plasmid）,质粒上携带有有利于微生物生存的基因,如能降解某些基质的酶,进行共生固氮,或产生抗生素(某些放线菌)等。,降解质粒:将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式,环境保护方面具有重要的意义。,假单胞菌： 具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4dichlo
15、rophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。,6、隐秘质粒（cryptic plasmid）,隐秘质粒不显示任何表型效应,它们的存在只有通过物理的方法,例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 它们存在的生物学意义,目前几乎不了解。,在应用上,很多隐秘质粒被加以改造作 为基因工程的载体 (一般加上抗性基因),是一类能在DNA分子内和DNA之间移动位置的一段DNA序列。 根据分子结构和遗传性质分为三类:插入序列（IS）、转座子（Tn）、 Mu噬菌体IS和Tn共同特征： 都带有编码转座酶的基因；两端都有反向末端重复序列,三）、转座因子的类型和分子结构,1、插入序列（IS）只
16、含有与转座有关的基因和序列，能在细菌染色体、噬菌体DNA和质粒上的许多位点移进移出。可编码特殊的酶和调节蛋白，但不给细菌表型特征。 2、转座子（Tn）与插入序列主要不同在于它携带有能赋予宿主某种遗传特性的基因，主要是抗性基因。能在细胞内从一个质粒转移到另一个质粒，亦可转移到染色体或前噬菌体上。,3、Mu噬菌体 具有转座功能的一类可引起突变的溶原性噬菌体。这类噬菌体的Mu基因组不论进入裂解周期或处于溶原状态均可整合,第三节 细菌基因转移和重组,细菌的三种水平基因转移形式,接合,转导,转化,细胞与细胞的直接接触(由F因子介导),转导(transduction)：,由噬菌体介导,转化 (natura
17、l genetic transformation)：,游离DNA分子 + 感受态细胞,一、接合(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的 遗传信息的转移和重组过程.,1.实验证据,1946年,Joshua Lederberg 和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,证实接合过程需要细胞间的直接接触的 “U”型管实验 ( Bernard Davis,1950 ),2. 机制,(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质 粒介导.,F因子的分子量通常为5107,上面 有编码细菌产生性
18、菌毛(sex pili)及控 制接合过程进行的20多个基因。,含有F因子的细胞:“雄性”菌株(F+),其细 胞表面有性菌毛;,不含F因子的细胞:“雌性”菌株(F-),细胞 表面没有性菌毛,F因子为附加体质粒,既可以脱离染色体 在细胞内独立存在,也可插入(整合)到染色 体上.,F因子的四种细胞形式,a)F-菌株, 不含F因子,没有性菌毛,可通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株(F+);,b)F+菌株, F因子独立存在,细胞表面有性菌毛;,c)Hfr菌株,F因子插入到染色体DNA上,细胞表面有性菌毛。,d)F菌株,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时,形成游离的但携带一小段染色体基因的F
19、因子,特称为F因子. 细胞表面同样有性菌毛。,3、杂交的结果 1） F+F-杂交,杂交的结果:给体细胞和受体细胞均成为F+细胞.,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌 株变成F-菌株.,F+菌株的F因子向F-细胞转移,但含F因子 的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移.,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上,因此只要发生接合转移过程,就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组,由此而得名为高频重组菌株。,2）Hfr F-杂交,染色体上越靠近F因子的先导区的基因,进入的机会就越多,在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,F因子不易转入受体细胞中, 故HfrF-杂交后的受体细
20、胞(或称接合子)大多数仍然 是F-。,3）FF-杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时,形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子,特称为F因子。,FF-与F+F-的不同:给体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞.,a)与染色体发生重组；,b)继续存在于F因子 上,形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导(se- xduction)、F因子转导(F-duction),或F因子 媒介的转导(F-mediated transduction).,二、转导（transduction）,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交 换的一种方式:一个细胞的DNA通过病毒 载体的感染转移
21、到另一个细胞中.,能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒 DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导 噬菌体.,细菌转导的二种类型:,普遍性转导,局限性转导,1.普遍性转导(generalized transduction),噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程.,(1) 意外的发现,1951年,Joshua Lederberg和Norton Zin-der为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用,用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行的实验:,用“U”型管进行同样的实验时,在给体和受体细胞不接触的情况下,同样出现原养型细菌！,沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的
22、溶 源性细菌另一株是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致 一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的,普遍性转导这一重要的基因转移途径 的发现,(2) 转导模型,转导噬菌体为什么“错”将宿主的DNA包裹进去?,噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割,以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳,形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒(假噬菌体).,因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同,利用效率较低,这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8,普遍性转导的两种后果:,进入受体的外
23、源DNA 通过与细胞染色体的 重组交换而形成稳定 的转导子,流产转导 (abortive transduction),转导DNA不能进行重组和复制,但其 携带的基因可经过转录而得到表达。,特点:在选择培养基平板上形成微小菌落,DNA不能复制,因此群体中仅一个细胞含有 DNA,而其它细胞只能得到其基因产物,形成 微小菌落。,2、局限性转导(specialized transduction),温和噬菌体感染,整合到细菌染色体特定位点上 宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时, 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定
24、基因 转移到受体菌中,2、局限性转导(specialized transduction),温和噬菌体裂解时的不正常切割:包含gal或bio基因(几率一般仅有10-6),缺陷噬菌体在宿主细胞内能 够象正常的DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能,形成转导颗粒.但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力,感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,局限性转导与普遍性转导的主要区别:,a)被转导的基因共价地与噬菌体DNA连 接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装 以及被导入受体细胞中.而普遍性转导包 装的可能全部是宿主菌的基因。,b)局限性转导颗粒携带特定的染色体片段 并将固定
25、的个别基因导入受体,故称为局 限性转导.而普遍性转导携带的宿主基因 具有随机性。,普遍性转导和局限性转导的比较,溶源转变(lysogenic conversion):,一个与转导相似又不同的现象,温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化,因噬菌体的基因整合到宿主染色体上,而使后者获得了新性状的现象。,溶源转变与转导的不同？,a)不携带任何供体菌的基因,b)这种噬菌体是完整的,而不是缺陷的,典型实例,Corynebacterium diphtheriae（白喉棒杆菌）：白喉毒素/温和噬菌体,三、转化 (genetic transformation),定义:同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA
26、)被自然或人工感受态细胞摄取,并得到表达的水平方向的基因转移过程,自然遗传转化(natural genetic transformation),人工转化(artificial transformation),感受态细胞:具有摄取外源DNA能力的细菌细胞.,（competent cell）,自然感受态与人工感受态的不同？,自然感受态的出现是细胞一定生长阶段 的生理特性，受细菌自身的基因控制；,人工感受态则是通过人为诱导的方法,使 细胞具有摄取DNA的能力或人为地将 DNA导入细胞内。,1、自然转化,1928年,Griffith发现肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae的转
27、化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然 转化的能力.,进行自然转化,需要二方面必要的条件:,建立了感受态的受体细胞,外源游离DNA分子,枯草芽孢杆菌的自然转化过程(革兰氏阳性菌的转化模型),自然遗传转化的进行涉及到细菌染色体上几十个基因的功能及彼此间的相互协调,因此被认为是名副其实 的细菌水平基因转移途径。,目前的研究热点：,1)细菌为什么要耗费如此多的染色体遗传资源来进行自然转化,即该过程的生物学意义到底何在?它对细菌自身有什么好处?,2)自然转化过程的很多细节仍不清楚,包括细菌如何协调感受态的建立,外源DNA进入和重组的具体过程等等,3)细菌中具有自然转化能力的范围,到底有那些菌具有自
28、然转化能力？,4)转化DNA的来源和在自然环境中发生的自 然转化,2、人工转化,用CaCl2处理细胞,电穿孔等是常用的人工转化手段.,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段,是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制.,用多种不同的技术处理受体细胞,使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”.,第八章 微生物遗传与变异,第四节 真核微生物 的基因重组,主要方式： 有性生殖 准性生殖,一、有性生殖一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体之间的独立分配和染色体之间的交换，并产生新遗传型后代的过程。,细胞（ ） 细胞（）,有性接合 染色体重组 新遗传型,能产生有性
29、孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,1、定义： 是通过两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。 存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中,二、准性生殖（parasexual hybridization）,2、准性生殖的过程：,异核体形成（质配） 异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一细胞质中生长。 异核体的特点： 具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体； 具有野生型性状，可在基本培养基上生长 ； （基因互补功能） 核融合形成杂合二倍体 体细胞交换和单倍体化。,体细胞交换和单倍体化,杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间
30、的交换、分离（单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。,A,B,A+B,（同核体）,（异核体）,A,A,B,B,AB,A,A,B,B,（杂合二倍体）,单倍体杂合子,第五节 微生物基因突变,一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变.,基因突变:,基因突变是重要的生物学现象,它是一切 生物变化的根源,连同基因转移、重组一 起提供了推动生物进化的遗传多变性。,突变,自发突变,诱变,环境因素的影响,DNA 复制过程的偶然错误等 而导致,一般频率较低, 通常为10-6-10-9 。,某些物理、化学因素对生 物体的DNA进行直接作用， 突变以较高的频率产生。,1、特点,1）非对应性
31、2）稀有性 3）规律性 4）独立性 5）遗传和回复性 6）可诱变性,一、基因突变的特点,证明突变的性状与引起突变的原因间 无直接对应关系！,如何证明基因突变的非对应性?,三个经典实验,变量实验、涂布实验、影印实验,2、实验证据,变量实验（fluctuation analysis）SalvadorLuria and Max Delbruck（1943）,Newcombe的涂布实验(1949),影印实验(replica plating) Joshua Lederberg and Esther Lederberg(1952),二、常见的微生物突变类型,表型,基因型,1）营养缺陷型(auxotroph
32、),一种缺乏合成其生存所必须的营养物(包 括氨基酸、维生素、碱基等)的突变型,只 有从周围环境或培养基中获得这些营养 或其前体物(precursor)才能生长。,营养缺陷型是微生物遗传学研究中重 要的选择标记和育种的重要手段,判断表型的标准:,在基本培养基上能否生长.,特点：,在选择培养基(常为基本培养基)上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,营养缺陷型(auxotroph),1),营养缺陷型的表示方法：,基因型:,所需营养物的前三个英文小写斜 体字母表示:hisC(组氨酸缺陷型,其中的大写 字母C同一表型中不同基因的突变）,表型:,同上, 第一个字母大写,且不用斜体： His
33、C.,在具体使用时多用hisC-和hisC+,分别表示缺 陷型和野生型。,2）抗药性突变型(resistant mutant),基因突变使菌株对某种或某几种药物,特 别是抗生素，产生抗性。,特点:,正选择标记(突变株可直接从抗性平板 上获得-在加有相应抗生素的平板上,只有抗 性突变能生长。所以很容易分离得到。),表示方法:,所抗药物的前三个小写斜体英文 字母加上“r”表示strr 和 strs 分别表示对链霉素 的抗性和敏感性。,3)条件致死突变型(conditional lethal mutant),在某一条件下具有致死效应,而在另一条件 下没有致死效应的突变型。,常用的条件致死突变是温度敏
34、感突变,用ts (temperature sensitive)表示,这类突变在高温 下(如42)是致死的,但可以在低温(如25-30) 下得到这种突变。,特点:,负选择标记,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,4)形态突变型(morphological mutant),造成形态改变的突变型,特点：,非选择性突变 突变株和野生型菌株均可生长,但 可从形态特征上进行区分。,举例：,产蛋白酶缺陷突变株的筛选,5）其它突变类型,毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。,突变率定义：每一
35、细胞在每一世代中发生某一性状突变的概率。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立的。,三、基因突变的分子基础,1、自发突变,无人为因素下的低频率突变原因： （1）背景辐射 （2）有害产物积累 （3）碱基错配,分子基础,基因突变的原因是多种多样的，从分子水平来说，突变是由于DNA分子碱基对发生变化所产生的结果。 碱基置换 （1）转换 A G T C即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换； （2）颠换：A T A CG C G T即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。,2、 诱发突变,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱
36、变剂 种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。,（1）碱基类似物如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5AU）等 作用方式： 主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。,5-BU引起的转换,（2）直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂,定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。 种类：例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。 作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从
37、而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。,亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。HNO2 胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）:AHNO2 腺嘌呤（A） 次黄嘌呤（H）:CHNO2 鸟嘌呤（G） 黄嘌呤（X）:G,碱基转换的分子机制以亚硝酸为例,（3）移码突变诱变剂,丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和-氨基丫啶等，以及一系列称为ICR类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂。,丫啶类化合物的诱变机制：,由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开，从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突
38、变。,（4）紫外线 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。,3、诱变剂与致癌物质Ames试验,a)利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种；,c)危害人类自身的健康.,b)对有害微生物进行控制；,很多种化学物质,能以各种机制导致 DNA的突变,回复突变(reverse mutation或back muta-tion):突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变.,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授 于1966年发明，因此称为Ames试验,具体操作:检测鼠伤寒沙门氏
39、菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株hisC-的回复突变率,艾姆氏试验的基本方法,缺陷型菌株,营养缺乏型平板,37 23天,. . . . . . .,. :. .: : . ; . ;. . .:,. :. .: : . ; . ;. . .:,. . . . . . .,待测试剂,正常回复突变,诱变剂诱变,艾姆氏试验已成为测试化学物质诱变作用的标准方法，其原理是检验待测试剂能否使营养缺陷型菌株的回复突变增加。,Ames试验,证明Ames试验重要性的应用实例：,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”,由于药效显著,在60-70年代十分流行,但随后人们
40、就发现畸形儿的出生率明显增高,而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”。后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用,因此这种药物被禁止使用.,一、诱变育种 定义：是用物理或化学的诱变剂使微生物遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,实践意义:,第六节 微生物育种,1.出发菌株的选择 出发菌株用来育种处理的起始菌株,出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力；,出发菌株的来源 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于
41、同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象;,2.敏感期和合适对象的选择,3.诱变剂的选择 剂量的表示法： 一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。 最适剂量的选择： 产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）,选择诱变剂的种类：紫外线亚硝基胍简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。,4. 菌种筛选,复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选方案： 将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：,与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：营养缺陷型：如：lys -， bi
42、o- 野生型：如：lys + ; bio + ; 原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。,营养缺陷型(auxotroph)的筛选,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。 完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。 补充培养基（SM）x：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。,营养缺陷型诱变筛选步骤及方法,auxo的鉴定,诱变处理,auxo的浓缩,auxo的检出,中间培养,（1）、淘汰野生型（缺陷型的浓缩）：,抗
43、生素法 原理： 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。 方法：将菌培养在含抗生素的MM基中,菌丝过滤法,适用于：丝状（放线菌、霉菌） 原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。,逐个检出法(点种法）：,（2）、缺陷型的检出：,影印平板培养法,夹层培养法,生长谱法,（3）、缺陷型的鉴定：,测定一般应分两阶段： 第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型； 第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,二、原生质体融合,概念：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双
44、亲性状的遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质体融合。 适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。 意义：,原生质体融合的优点：可以提高重组率双亲可以少带标记或不带标记可进行多亲本融合有利于不同种间、属间微生物的杂交通过原生质体融合提高产量,1、选择亲株 2、制备原生质体,原生质体融合的主要步骤：,细菌：溶菌酶；酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶或纤维素酶3、原生质体融合 化学因子：PEG，物理因子：电融合技术 4、原生质体再生5、筛选优良性状的 融合重组子,第七节 菌种保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生
45、产或科研都无法正常进行。,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）变异；,b）污染；,c）死亡；,一、菌种的衰退与复壮,菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的原因：基因突变，分离现象。,菌种衰退:,菌种的复壮：,1)从衰退的菌种群体中把少数个体再找 出来,重新获得具有原有典型性状的菌种。,2)有意识地利用微生物会发生自发突变的 特性,在日常的菌种维护工作中不断筛选 “正变”个体。,a)纯种分离；,b)通过寄主体进行复壮；,二、防止衰退的措施,1)减少传代次数；,2)创造良好的培养条件；,3)经常进行纯种分离,并对相应的
46、性状指标进行检查；,4)采用有效的菌种保藏方法；,三、菌种保藏,在一定时间内使菌种不死,不变,不乱,基本要求：,基本方法:,生活态休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面,平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真 空干燥,几种常用菌种保藏方法的比较,简便 简便 简便 简便有效 简便有效,36月 612月 12年 110年515年以上,各大类 细菌、酵母菌 各大类* 产孢子微生物各大类,低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂,冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法* 沙土保藏法冷冻干燥法,评价,保藏期,适宜菌种,主要措施,方法名称,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,
