1、1分子生物学与基因工程 复习中心法则复制 1.半保留复制2.半不连续复制3.复制起点固定, 双向, 等速复制. 4.复制中的信号: (1)复制 起点 : 原核 ori, 真核 ARS(2) 复制终点原核和真核复制的主要差异: 复制起点( 原核 1, 真核多);复制次数(原核多次, 真核 1 次)真核 S 期复制 , 端粒的复制复制的几种特殊形式环状 DNA 复制:(1) 型 -双向, 大肠杆菌(正常);(2) 滚环型 -单向,切割, X174;(3) D-环型-单向, 线粒体.病毒中存在全保留复制方式, 逆转录复制方式.复制中信号保真 (原核为例) 1. 复制中, 复制酶 35外切酶的矫正功能
2、;2. 复制后的二次矫正( 母链甲基化). DNA RNA RNA2DNA 的转座转座: 染色体上可自主复制和移动一段核酸序列 .分类: (1) 复制性转座( TnA)-拷贝(2) 非复制性转座( IS )-整个移动1.很小,1kb 左右,编码转座酶 ;2.末端有倒置重复序列,其外侧还有一小段正置重复序列 (转座时, 复制靶序列形成)3.,特定 IS,靶序列一样; 不同 IS,靶序列不一样 转录 转录通论 一. RNA 转录的一般过程1.模板识别 2.转录起始 3.通过启动子 4.转录的延伸 5.终止二.转录的原料:1.RNA 聚合酶; 2.双链 DNA 模板; 3. NTPs ; 4.辅助因
3、子三. 转录的方向:5 3 (模板链 / 编码链)四. 转录中模板上的信号: (保守序列)启动子( promotor), 终止子( terminator) 调控序列( 操纵子 operator, 增强子 enhancer )五.不对称转录一.原核生物转录的特点RNA 聚合酶( 2 ): 全酶 = 核心酶 + 提高酶与启动子序列的亲和力(10 3),降低与非特异序列的亲和力(10 4), 启动子（promoter） Pribnow box 即 -10 box -10 box 与-35 box 的最佳距离为 17 1 bp +1 一般为 A (mRNA 转录起始点) 越接近保守序列, 起动子越强.
4、转录终止 (终止子)(1)不依赖于 因子的终止 强终止子 =“一段反向互补序列“ + “一段富含 T 的区域”(2)依赖于 因子的终止. 弱终止子 =“ 一段反向互补序列 “ 二.真核生物 mRNA 转录1.RNA 聚合酶 II2.II 类启动子3增强子(沉默子) 无方向, 位置, 距离的限制 具有组织特异性 有时两者可相互转换. 不属于启动子 , 能调节基因的转录 . 起动子,增强子与沉默子都属于顺式作用元件.真核生物的转录因子 起始,延伸, 终止都需要因子的帮助.(与原核转录的区别) 分为: (1) 通用转录因子-都需要(2) 基因特异转录因子 -调控转录终止 1. 没有明确的终止子,但有
5、终止信号2.转录会在 AATAAA 下游 0.5-2kb 处终止(AATAAA 下游 15-30bp 加PolyA)前体 mRNA 的加工(时序性) (1) 5加帽 (转录早期进行 30 nt)(2) 3加尾 (前体 mRNA 加 polyA)(3) 切除内含子(4) 编辑和修饰5 cap 的特殊结构和功能3 m7GpppNmNm-3 (G 的方向与 N 的方向相反,通过 5-5相连)功能: (1) 保护 mRNA(2) 提高翻译能力（效率）(3) 有利于 mRNA 在细胞内的运输（运出细胞核）(4) 使 mRNA 前体的能正确剪接 (第一个内含子)poly(A)的功能(1) 保护 mRNA：
6、延长其寿命（半衰期）(2) 提高 mRNA 的翻译能力：能与 poly(A)结合蛋白 结合，促进翻译，促进mRNA 与核糖体结合(3) poly(A)能促进最后一个内含子的剪接 (3) RNA 剪接（RNA splicing）4 剪接信号 (属于内含子的边界)主要: GU-AG (剪切体)次要: AU-AC自我剪切的 I, II 内含子 剪接体 : snRNAs (核小分子 RNA)参与特殊剪接方式 选择性剪接: 一个基因转录出来的 RNA 前体，通过不同的剪接方式（选择不同的外显子）而形成不同的成熟 mRNA，产生不同的蛋白质 反式剪接 : 参与剪接的外显子并不在同一个基因中（即在不同的 R
7、NA 分子中） RNA 编辑 在特定位点: 改变,插入,删除核苷酸 . 在转录后进行，沿 3 5方向进行; 由 gRNA（guide RNA，向导 RNA）指导进行; 因是 RNARNA, 存在 G-U 配对.翻译 蛋白翻译通论 一.合成过程 1. 翻译的起始-2. 肽链的延伸-3. 肽链的终止及释放 二. 蛋白质生物合成体系 1、mRNA; 2、核糖体; 3、tRNA; 4、起始因子、延长因子和终止因子; 5、氨基酰-tRNA 合成酶 三.氨基酸的活化与搬运 AA-tRNA 四. 蛋白质前体的加工, 折叠 五. 蛋白的定向转运 六. 蛋白的降解密码子的特点 遗传密码：三联体密码 遗传密码的特
8、点：连续性,有起始密码(AUG, (原核中也用 GUG)和终止密码(UAA,UAG,UGA),简并性 ,摆动性.通用性, 偏好性tRNA：接合器 一种 tRNA 只能与一种氨基酸结合，一种氨基酸可与几种 tRNA 结合。(tRNA 数目20)5 结合位点为：3端 CCA-OH。 Ala-tRNAala; 起始 tRNA fmet-tRNAfmet： (原核生物）Met-tRNAimet 起始 tRNA (真核生物） met-tRNAemet;携带延长中的肽链上的蛋氨酸(真核生物）氨基酰-tRNA 合成酶 既能识别特定的氨基酸，又能识别转运该氨基酸的 tRNA。 氨酰 tRNA 合成酶的专一性很
9、高，共有 20 种，每一种只用于单一种氨基酸与相应 tRNA 的结合 (氨基酸专一, tRNA 有多个 ). 氨基酸+ATP+tRNA 氨基酰-tRNA +AMP +PPi 氨基酰-tRNA 合成酶可发挥较对功能，使误载的氨基酰-tRNA 从 tRNA 上释下，保证遗传信息翻译的准确性。原核生物的蛋白翻译 1. tRNA 装载在氨酰 tRNA 合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase）的作用下，使氨基酸连接到 tRNA 3端的腺苷酸上，形成氨酰 tRNA (fmet-tRNA) 2. 核糖体解离 翻译起始复合物首先是在核糖体小亚基上组装起来 每一次翻译后，核糖体的大小亚基必须
10、解离，以让新的翻译起始复合物形成 核糖体解离需要起始因子（initiation factors，IF）的协助 3. mRNA 与小亚基结合。AUG 上游 813 个碱基处存在 SD 序列能与小亚基中 16S rRNA 3端序列互补。 4、fmet-tRNA 的结合：fMet-tRNA 进入小亚基的 P 位, 反密码子与 mRNA 起始密码子配对; 5、大亚基结合 6. 延伸Step 1：进位 (注册)(1) 一个新的氨酰 tRNA 结合到核糖体的 A 位 (2) 校对（proofreading）:如错误的氨酰 tRNA 进入了 A 位（反密码子与密码子不能很好配对） ，可进行校正. Step
11、2：转肽大亚基的 23S rRNA, 肽基转移酶, 形成肽键Step 3：移位 mRNA 与肽基 tRNA（ peptidyl-tRNA）移动 1 个密码子的距离，使肽基 tRNA 进入 P 位，而原在 P 位的 tRNA 离开核糖体 7. 终止(1) 翻译到达终止密码子后，释放因子及 GTP 结合到核糖体的相应位点，促6使肽链与 tRNA 的连结断开(2) 接着释放因子和 tRNA 从核糖体解离(3) 最后，核糖体与 mRNA 解离，核糖体大小亚基解离真核生物蛋白质合成的特点 起始阶段（1）在核内合成 mRNA 前体，加工并与多种蛋白质结合成核蛋白颗粒，转入胞浆。起始时其二级结构需要松解，并
12、放出多余的蛋白质。（2）Met-tRNA iMet （3） 起始复合物：40S-mRNA-Met-tRNA iMet（4）没有 SD 序列。5cap 和 3 ployA 参与形成翻译起始复合物. 第一个 AUG 不一定是起始密码 与在其周围，往往有共同序列 Kozak 序列 CCRCCAUGG (R,嘌呤) 还与高级结构有关肽链的翻译后加工（1）N 末端的甲酰甲硫氨酸（原核）或甲硫氨酸（真核）的切除; （2）二硫键的形成（3）修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化等（4）多聚蛋白前体的切割, 切除新生肽链中非功能片段, 信号肽的处理.（5）蛋白质剪接：除去蛋白质内含子（intein）(6
13、) 新生肽链的折叠(7) 亚单位聚合基因表达调控 基因表达的时间性及空间性 基因表达方式（1）管家基因与奢侈基因（2）诱导和阻遏表达 基因表达的调控方式：多级调控， 转录调控最重要 影响基因表达的因素：（1）原核: 营养状况, 环境因素;（2）真核: 激素水平, 发育阶段.一. 原核生物基因表达的调控 转录与翻译相耦联。 分为：（1） 转录水平的调控：操纵子（2）翻译水平的调控 启动子对转录的影响 （1）启动子决定转录方向及模板链 (2) 启动子决定转录效率 原核基因 转录水平 的调控操纵子 =启动子 + 操纵基因 + 结构基因 7转录的调控机制 (范例) 乳糖操纵子调控的机制 (分解代谢)
14、色氨酸操纵子的调控机制(合成代谢) RNA lac ALac YLac ZOPi mRNA- - lac ALac YLac ZOPi:cAMPc()()8-35-100CAPcAMP ORNA二.真核生物基因表达的调控 DNA 水平的调控* 转录水平的调控 转录后水平的调控* 翻译水平的调控 翻译后水平的调控* DNA 水平的调控 染色质的丢失 基因扩增 基因重排 DNA 甲基化 (表达降低, X 染色体失活中心) 染色体结构 (常染色质 和 异染色质)转录水平的调控- 最重要 转录起始 顺式作用元件 和 反式作用因子; 以正调控为主反式作用因子特点 三个功能结构域：(1) DNA 识别结合
15、域；(2) 转录活性域 (3) 结合其他蛋白的结合域 能识别并结合顺式作用元件 正调控与负调控反式作用因子结构域的模式 DNA 结合域9(1) 锌 指 结 构(2) 螺 旋- 转 角- 螺旋(HTH)(3) 亮 氨 酸 拉 链(4) 螺 旋- 环- 螺 旋(HLH) 转录活化结构域 (1) 酸性 -螺旋结构域 (2) 富含谷氨酰胺结构域 (3) 富含脯氨酸结构域 转录起始的调控 反式作用因子的活性调节 (1) 合成后即有活性：需要时合成，可迅速降解 (2) 共价修饰：磷酸化 -去磷酸化，糖基化 (3) 配体结合：如激素与受体的结合 (4) 蛋白质与蛋白质相互作用：二聚体 反式作用因子与顺式作用元件, 通过成环等方式调控 反式作用因子间存在组合式调控. 转录后水平的调控 mRNA 的选择性剪接mRNA 运输的控制 转录后的基因沉默*（ RNA 干涉, RNAi） 翻译水平的调控 翻译起始的调控:(1) 激活隐蔽 mRNA(2)阻遏蛋白的调控(3)翻译起始因子的调控(4) 5AUG 对翻译的调控作用(5) mRNA5 端非编码区长度对翻译的影响 mRNA 稳定性调节 小分子 RNA 对翻译水平的影响翻译后水平的调控 新生肽链的水解:肽链 N 端的第一个氨基酸决定蛋白的半衰期 肽链中氨基酸的共价修饰:磷酸化*、甲基化、酰基化 通过信号肽分拣、运输、定位
