1、第一章 绪论1 生物技术 是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。2 生物技术的主要内容：P1基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。3 生物技术制药 采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为 4 生物技术药物 采用 DNA 重组技术或其它生物新技术研制的
2、蛋白质或核酸类药物才能被称为 5 生物药物 生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为 PPT 复习题第二章 基因工程制药 1、简述基因工程制药的基本程序。P162、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。P15 第一段第一行3、采用哪两种方法来确定目的 cDNA 克隆？P18（7 目的基因 cDNA 的分离和鉴定）核酸探针杂交法用层析法或高分辨率电泳技术 (蛋白质双向电泳技术或质谱技术 )分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与 cDNA 文库中的每一个克隆杂交。这个方法的关键是分离目的蛋白，免疫反应鉴定法（酶联免疫
3、吸附检测 ）4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的 6 个困难。 原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难； 原核基因表达产物在细胞内多为不溶性( 包含体, inclusion body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂； 没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制； 产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成 N-Met 冗余，做为药物，容易引起免疫反应； 细菌的内毒素不容易清除； 细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化；5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？蓝藻：很有前途的药物基因的宿主
4、细胞 有内源质粒，美国 Wolk 实验室已构建 1200 种人工 质粒，可用做基因载体。 载体转化蓝藻不需要诱发感受态就可以做到； 外源基因产物不形成包含体，分离与纯化工艺可以大大被简化； 可以直接食用，等于直接口服药物6、结合 pBG-2 说明选择用于 E. coli 细胞宿主中的载体的 6 项原则。P23 与 pBV220 优点类似，原则 P227、简述基因工程菌中质粒不稳定的两个指标？P32 如何计算质粒的稳定性？P33 质粒稳定性分析方法（ST=出现的菌落数/100 ）8、 简述提高质粒稳定性的两步培养法 P33 分阶段控制培养普遍使用的两步培养法，是在接种后只让菌体细胞快速分裂，这一
5、步培养过程中，外源基因不表达；然后再诱导载体上的药物基因以最高效率表达，积累药物蛋白。9、简述基因工程药物分离纯化工艺设计中必须考虑的药物的 5 个特点。P46 （摘自PPT） 在初始物料中的含量低：药物分离困难。外源基因表达尽管是在菌体生长对数期被诱导的，在与菌体生长过程中的代谢产物比较，在发酵产物的初始物料中含量也是很低的。 初始物料的成分复杂：不利于药物蛋白的分离与纯化。除了药物基因产物外，菌体细胞、代谢产物、残留的培养基、无机盐，尤其是药物蛋白的类似物。 药物蛋白的稳定性差：分离与纯化条件相对苛刻。容易失活或变性，对各种物理化学因素十分敏感。 分离与纯化的技术差异大：基因工程药物种类繁
6、多、结构复杂。不同的药物分离与纯化必须考虑其分子特征。 对不同药物的质量和纯度有不同的要求：药品质量标准是根据药物的应用制定的，没有统一的制备、分离、纯化的标准。第三章 动物细胞工程制药1、解释动物细胞的两种培养方式。动物细胞培养大致可分为两种：群体培养(mass culture)是把一定数量的细胞悬浮液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成单细胞层。克隆培养(clonal culture)是将高度稀释的游离细胞悬浮液置于培养瓶中，各个细胞贴壁后彼此距离较远，经过生长增殖，每一个细胞集落均来源于一个细胞祖先，称为一个“克隆”(“clone”)。2、举例说明三种细胞培养
7、特征。P801、贴壁细胞：生长须有贴附的支持物表面；贴附因子来自培养基或细胞自身分泌。有两种细胞类型：成纤维细胞型、上皮细胞型。2、悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞。3、兼性贴壁细胞：生长对贴壁支持物表面要求不严格。如中国地鼠卵巢细胞（CHO） ，小鼠 L929 细胞。3、细胞系与细胞株的区别是什么？细胞系(cell line)：从原代培养经传代培养后得到的一群不均一的细胞，可以连续培养，即这些细胞具备培养条件下的无限增殖能力。细胞株(cell strain)：通过选择或克隆化，从原代培养的细胞群获得的、具有特殊遗传/生化性质或特异性标记的细胞群。细胞株强调培养的
8、细胞的单一性特征，即克隆本质；而细胞系并不强调细胞的纯度，可以包含多种细胞，但主类细胞占大多数。4、说明动物细胞培养生产药物的优缺点。缺点：培养条件苛刻、成本高、产量低。优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。5、如何获得二倍体细胞株？PF86 何为二倍体细胞株 从动物胚胎组织中获得 从各国细胞库或有关机构获取（P87第二段）6、举例说明两类基因工程细胞。A. 病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、杆状病毒B. 质粒载体：穿梭质粒载体7、简单但全面叙述杆状病毒昆虫细胞表达系统。 （需总结概括）杆状病毒(Baculoviruses)是昆虫病毒，128 kb 双链 DNA 基
9、因组。优点 P88杆状病毒基因组比较大，一般用同源重组方法引入外源基因。构建过程： 插入位点：多角体蛋白基因启动子的后面； 操作方式：重组质粒与杆状病毒共同转染昆虫细胞，获得发生同源性重组的、含有外源基因的病毒颗粒； 导入细胞：重组病毒载体感染昆虫细胞(如 Sf-9 细胞株)(如果用的是 BmNPV，可以直接感染家蚕，获得转基因动物。)8、构建基因工程细胞选择质粒载体所考虑的 4 个问题。P88 最后一段9、说明动物血清在细胞培养中的作用。提供生长因子和激素 提供贴壁因子和伸展因子 提供结合蛋白 提供必需脂肪酸和微量元素10、细胞大量培养为什么必须使用无血清培养基？ 提高细胞培养的可重复性，避
10、免血清差异的影响； 减少血清带来的污染； 供应及时、稳定、充足； 细胞产品容易纯化； 避免血清某些成分对细胞的毒性； 减少血清蛋白对生物测定的干扰。第四章 抗体制药1、画图说明抗体分子（IgG）的结构，指出 Fab、Fv、Fc 和 Fd。P1512、说明单克隆抗体在医疗和研究中的三个用途。详见 P143单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。如 1.利用单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。2.用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。3.单克隆抗体制剂也用于临床治疗，如针对 T 淋巴细胞共有的分化抗原CD3 的单克隆抗体，因其对器官移植排斥反应有显
11、著的抑制效果，用作免疫抑制剂已在美国标准上市。3、获得单克隆抗体为什么必须使用杂交瘤技术？度娘杂交瘤技术杂 交 瘤 技 术 的 基 本 原 理 是 通 过 融 合 两 种 细 胞 而 同 时 保 持 两 者 的 主 要 特 征 。 这 两 种 细 胞 分别 是 经 抗 原 免 疫 的 小 鼠 脾 细 胞 和 小 鼠 骨 髓 瘤 细 胞 。 被 特 异 性 抗 原 免 疫 的 小 鼠 脾 细 胞 （ B淋 巴 细 胞 ） 的 主 要 特 征 是 它 的 抗 体 分 泌 功 能 ， 但 不 能 在 体 外 连 续 培 养 ， 小 鼠 骨 髓 瘤 细 胞则 可 在 培 养 条 件 下 无 限 分 裂
12、 、 增 殖 ， 即 具 有 所 谓 永 生 性 。 在 选 择 培 养 基 的 作 用 下 ， 只 有B 细 胞 与 骨 髓 瘤 细 胞 融 合 的 杂 交 细 胞 才 能 具 有 持 续 培 养 的 能 力 ， 形 成 同 时 具 备 抗 体 分 泌功 能 和 保 持 细 胞 永 生 性 两 种 特 征 的 细 胞 克 隆 。4、什么是 HAT 选择？P146 最后一段5、说明检测杂交瘤的细胞学方法的原理。P148动物的染色体制片技术相对简单，在普通光学显微镜下就可以确定染色体核型(chromosome karyotype) 。小鼠的染色体全部都是端部着丝点染色体，2n=40；骨髓瘤细胞染
13、色体数目大于40，2n40，并且有骨髓瘤特有的标记染色体。所以，杂交瘤细胞的染色体数目应该是两种细胞染色体数之和。由于有 HAT 选择在前，用核型分析确定杂交瘤细胞只有一个条件：2n80。6、说明对鼠原性单克隆抗体改造的两个原则。降低免疫原性、降低分子量。7、说明 CD4-Ig 抗 HIV 的原理。HIV 感染就是其 gp120 专一性结合淋巴 T 细胞巨噬细胞表面的细胞受体 CD4 (CD4 是 T 细胞重要的活化因子)，使 T 细胞和巨噬细胞失去对 HIV 和其它病原体的免疫攻击能力。CD4-IgG 是把分化抗原 CD4 结合到 IgG 的 FC 区，称免疫黏连素。HIV 表面的 gp12
14、0 只有一个与 CD4 结合的位点，只要免疫黏连素 CD4-IgG 分子与 gp120结合， HIV 就失去了感染能力。10、说明细胞因子 IL-1 和 IL-2 的免疫学功能。爱咋咋地11、为什么噬菌体表面展示和 PCR 技术是抗体库构建的两项分子生物学技术基础。噬菌体表面展示技术 (phage display)被广泛应用于抗体库构建，成为目前使用的噬菌体抗体库技术 (phage antibody library)。噬菌体表面展示，即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因
15、此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体，并且将抗体基因克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，在数日内即可筛出阳性克隆，从而能构建出大库容（108）文库囊括天然全套抗体基因，使抗体工程的设想成为现实。第五章 植物细胞制药1、解释：初级代谢产物、次生代谢产物、外植体 P1782、说明培养基中的碳、氮、无机盐和生长因素。P1863、说明植物细胞培养基中的碳源来源及其作用。P1954、说明常用的植物生长素与细胞分裂素。P1895、培养
16、基中生长素与细胞分裂素的配比的效应。生长素/细胞分裂素 :高 ,有利于根和愈伤组织的形成. 适中,有利于根芽的分化.低,有利于芽的形成6、举例说明诱导子在培养中的作用。P2047、举例说明什么是前体饲养？P206第七章 发酵工程制药1、现代生物技术改造传统制药工业体现在哪四个方面？（1）抗生素生产：分离抗生素合成酶基因，提高产量、得到杂合抗生素；（2）氨基酸生产：基因克隆的工程菌、细胞融合育种；（3）维生素生产：构建制造维生素 C 的基因工程菌；（4）疫苗生产：把抗原克隆到 E. coli 中大量生产疫苗。2、抗生素生物合成基因群成员的三个结构特点。P2833、简要说明提高抗生素的产量的四项措施。P2944、为什么增加抗性基因的拷贝数可以提高工程菌的抗生素产量 P294
