1、生物技术制药第一章 绪论药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及 微生物与生化药学 二级学科生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类 按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用 DNA 芯片) 按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA 干扰 (RNAi)药物、基因治疗药物 按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物生物技术药物的特性 理化性质特性：相对分子
2、量大、结构复杂、稳定性差 药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性 生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染 质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等)第二章 基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的
3、遗传毒性实验 )；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞 DNA 残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG 修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长 t1/2)基因工程制药基本环节 上游阶段：制备目的基因构建重组质粒构建工程细胞 下游阶段：培养工程细胞分离纯化产物除菌半成品、成品检定包装基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞 酶切结果：5粘性末端、3粘性末端、平头末端 1U
4、 核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1mg 标准 DNA 所需的酶量 影响限制性内切酶反应的因素： DNA 样品的纯度： DNA 的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒 DNA。 酶切反应的温度 DNA 的分子结构 反应缓冲液组成 反应时间、反应体积等 工具酶 核酸限制性内切酶：识别、水解外源的双链 DNA 分子上特定的核苷酸序列。主要存在于原核微生物中。 同裂酶：指来源不同，识别序列相同的酶；进行同样的切割，产生相同的末端 同尾酶：来源不同，识别序列不同，但产生相同的粘性末端DNA 甲基化酶
5、：具有宿主专一性，对宿主自身 DNA 上特定核苷酸进行甲基化修饰， 避免被自身限制性内切酶水解 DNA 连接酶 T4 噬菌体连接酶：连接双链 DNA 切口，或带粘性末端或平头末端的 DNA 片段 大肠杆菌 DNA 连接酶：连接双链 DNA 切口，或带粘性末端的 DNA 片，不能连接带平头末端的DNA 片段 聚合酶：以 DNA 或 RNA 为模板，将核苷酸连续加至 3-OH 末端，合成方向为 53 。DNA 聚合酶、RNA 聚合酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶：53 DNA 聚合酶活性；53 DNA 外切酶活性；35DNA 外切酶活性；RNA H 酶活性 Klenow 酶：不具备 53DNA 外切酶
6、活性 T4 噬菌体 DNA 聚合酶：不具备 53DNA 外切酶活性。外切酶活性比 Klenow 酶强 200 倍，对单链 DNA 作用强于双链 DNA T7 噬菌体 DNA 聚合酶：不具备 53 DNA 外切酶活性 Taq DNA 聚合酶 反转录酶：催化以 RNA 或 DNA 为模板，合成 DNA；具有 RNA H 酶的活性 末端脱氧核苷酸转移酶：催化 dNTP 沿 53 聚合，逐个加于线性 DNA 分子的 3末端；不需要模板 载体：(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的 DNA 分子，可供插入或克隆目的基因或 DNA，并具有运载外源 DNA 导入宿主细胞的能力。 质粒载体：共价闭合环状
7、DNA(cccDNA)；开环 DNA(ocDNA)；线状 DNA(lDNA) 质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性 用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点 常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体 噬菌体载体：插入型载体、置换载体 来源于噬菌体 DNA，因可以插入较大 DNA 片段，常用于构建基因组文库和 cDNA 文库。 目的基因的常用制备方法 化学合成法：前提：基因的 DNA 的序列已知。小于 100bp 的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。 大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法 PCR 法：前提：已知待扩增目的基因或 DNA
8、 片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。 基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆分离 cDNA 文库法(与 mRNA 互补的 DNA)并非所有的 mRNA 分子都具有 polyA 结构；仅限于克隆蛋白质编码基因；mRNA 含量少且 t1/2 短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难第一链：mRNA 模板，引物 (polyT) ，逆转录酶，dNTPs第二链：自身引导法：取得的双链 cDNA5端会有几对碱基缺失(NaOH，煮沸；Klenow 酶，dNTPs；S1 内切酶)引导合成法：获得的 cDNA 能保持完整的 5端序列(TdT, Dctp；NaOH；退火；Klenow 酶
9、，dNTPs) 基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数 N 之间的关系可用下式表示：N= ln(1P) /ln(1f)，P= 完备性，f= 克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小 双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性 影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于 1；连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系 重组 DNA 导入宿主细胞 导入大肠杆菌：CaCl2 法；转染法 导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法 导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法 重组 DNA 导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE 葡聚
10、糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法 重组子的筛选与鉴定 遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法； 互补筛选法(蓝白斑筛选 载体含有 LacZ 基因，X-gal 培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法 核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA 印迹法；RNA 印迹法 限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆 DNA 序列测定法 目的基因表达产物测定法原核细胞表达的特点及选择 大肠杆菌(首选, 遗传背景研究清楚；适合大规模生产(成本低，周期短，效率高，操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等 缺点：缺乏翻
11、译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解 外源基因表达的调控原件：复制子、启动子 (表达效率的关键因素 )和终止子、核糖体结合位点( 即 SD序列及 SD 序列到起始密码子 AUG 的距离) 、识别翻译后修饰信号 用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子(一般有)、强的终止子，所产生的 mRNA 应具有翻译起始信号(起始密码子 AUG 以及 SD 序列) 外源基因在大肠杆菌中的表达方式 胞内表达：非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除
12、原核多肽，获得天然外源蛋白 分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达 外源蛋白表达效率的影响因素 外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子 mRNA 的结构：改变一级结构；降低 5端二级结构稳定性；调控 3端非翻译区二级结构 表达载体的选择：表达方式；强的复制子( 拷贝数高)；强的启动子(转录效率高)；高效率的核糖体结合位点；强的终止子(提高 mRNA 稳定性)；适应范围广；稳定性高；产物易纯化。 外源蛋白的稳定性：采用融合蛋白形式表达；采用蛋白酶缺陷的突变菌株真核细胞表达的特点及选择 常用的真核表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达
13、系统、哺乳动物细胞表达系统大肠杆菌和酵母表达系统的比较大肠杆菌 巴斯德毕赤酵母载体 原核载体 穿梭载体调控序列 原核 原核和真核表达形式 包涵体、融合蛋白、分泌 分泌翻译后修饰 基本无 有生产方式 发酵，操作简单、经济 发酵，操作较简单、较经济 酵母表达体系的影响因素 外源基因的结构 外源基因 5端非翻译区的序列和长度影响 mRNA 的翻译效率 起始密码子两侧若容易形成 RNA 二级结构，将阻止翻译进行 富含 A-T 序列导致转录提前终止 密码子的偏好性 高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率 表达形式及信号肽的选择：无信号肽常胞内表达；有信号肽，胞外分泌型表达 启动子：多数毕赤酵母采用乙醇氧化
14、酶 AOX1、AOX2 启动子 转化子的拷贝数：拷贝数越高，表达水平也越高 诱导条件：甲醇诱导的浓度、时间以及温度的选择 外源蛋白的降解：采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或调节 pH 值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的稳定性。 哺乳动物细胞表达系统 表达载体：病毒载体( 腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等)；质粒载体 表达方式：瞬时表达、稳定表达、诱导表达 基因重组蛋白的主要分离技术：离心、沉淀(等电点沉淀法、盐析法)、膜分离、双水相萃取 基因重组蛋白的主要纯化技术：离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱 选择分离纯化方法的依据 根据表达形式选择分泌型：沉淀和超滤周质表达：溶菌酶处
15、理渗透压休克胞内可溶表达：亲和层析或离子交换层析胞内不溶表达( 包涵体)：易与杂蛋白分开，但需要复性形成有活性的蛋白质。 根据分离单元之间的衔接选择先采用低分辨、分离规模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分离规模小、速度慢的方法。合理选择色谱分离次序 根据分离纯化工艺的要求选择具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性；尽量较少组成工艺步骤；所用时间尽可能短；工艺和技术必须高效 基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面 Mr 远大于小分子化学物质，致使适用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。如质谱 基因工程药物结构复杂，常需多种检测方法 两者杂质性质差别较大。小分子药
16、物杂质主要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留；基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留，其检测一般都用专用的试剂盒。 药物定量方面，基因工程药物一般采用生化反应的方式 基因工程药物的质量控制1、蛋白质含量的测定 紫外吸收光谱：在 280nm 有最大吸收值。快速，无破坏性。不是严格定量，核酸可引起强干扰作用。 BCA 法：碱性条件与 Cu2 络合同时将 Cu 2 还原成 Cu (双缩脲反应)，再与二辛可宁酸形成紫色复合物，在 562nm 有最大吸收值。需短时间 10min 内完成 Lowry 法： 碱性条件蛋白质与铜形成复合物可还原磷钼酸磷钨酸试剂，产生深蓝色。特点：灵敏，准确度
17、高；操作步骤多，繁琐；影响因素多(盐酸胍、尿素、EDTA 等) 考马斯亮蓝法：灵敏，操作简单，重复性好；抗干扰能力弱 SDS-凝胶染色与扫描分析法2、蛋白质纯度的测定：电泳(SDS-PAGE)、质谱法、色谱法、末端氨基酸分析法3、蛋白质分子量的测定：SDS-PAGE、凝胶色谱、质谱法4、蛋白质等电点的测定5、蛋白质序列分析 N 末端氨基酸序列分析：鉴定蛋白质的种类；C 末端分析：判断表达、纯化过程中有无加工6、蛋白质二硫键分析7、蛋白质活性的测定8、免疫测定法9、内毒素分析、宿主蛋白和核酸残留分析基因工程药物的实例：干扰素(IFN)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CMCSF)、人白细胞介素-2
18、(IL-2) 、胰岛素、人生长激素(hGH)第三章 动物细胞工程制药动物细胞的体外培养 体外培养动物细胞的形态：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞贴壁依赖性细胞：成纤维样细胞型( 主要来源于中胚层组织 )；上皮样细胞型(主要来源于外胚层和内胚层组织)非贴壁依赖性细胞：又叫悬浮细胞，一般呈圆球形。主要来源于血液、淋巴组织、杂交瘤细胞兼性贴壁细胞：如 CHO 细胞、小鼠 L929 细胞动物细胞的生理特点1) 细胞的分裂周期长，一般为 1248h(G1 S G2 M)2) 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象3) 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的4) 动物细胞对周围环境十分敏感(如渗透
19、压、pH 、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱)5) 动物细胞对培养基的要求高(需要 12 种必需氨基酸、8 种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳源的葡萄糖，以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。)6) 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同培养条件要求高、成本贵，产量低；多半是分泌在胞外的，收集纯化方便，得到了较完善的翻译后修饰 动物细胞培养的条件(一 )环境条件： 直接接触的器材、防止污染(显著地污染标志：pH 值迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现细胞集落)、水质、pH( 大多是 7.2-7.4)、渗透压、温度、通氧量、基本营养物质(二 )营
20、养要求：水、碳源、氮源、维生素、激素、无机盐等 碳源不能为无机物，大多只能利用葡萄糖 氮源不能为无机物，主要利用各种氨基酸 在多数情况下，需要添加 520 的小牛血清，或适量动物胚胎浸出液。培养基：天然培养基，合成培养基，无血清培养基 天然培养基：主要见于早期阶段，来源：血浆凝块、淋巴液、血清(最常用有效) 、羊水、腹水等。分维持液(低或不含牛血清)和生长液 (5%-20%牛血清) 合成培养基：主要成分：糖、氨基酸、核苷酸前体、维生素、激素、缓冲体系、无机盐等 无血清培养基提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批之间差异的影响；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足
21、、稳定；细胞产品容易纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析血清的作用：提供各种生长因子和激素，贴附因子和伸展因子，可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白，必须的脂肪酸和微量元素 其他常用溶液：平衡盐溶液；培养基 pH 调整液；细胞消化液(胰蛋白酶，EDTA)；抗生素溶液动物细胞培养的基本技术和方法 动物细胞培养的方法：原代培养、传代培养、克隆培养 细胞的原代培养：组织块培养法、单层细胞培养法。取动物组织块剪碎分散处理(加胰蛋白酶或胶原蛋白和 EDTA) 洗涤纯化 计数稀释培养 细胞的传代培养：离心或酶消化法收获细胞，计数后，以适当
22、浓度接种到新的培养环境中 单克隆培养动物细胞培养的基本技术：细胞分离(离心法；蛋白酶消化法)；细胞计数；细胞传代；细胞的冻存(慢冻，液氮,196 度) 和复苏(快融，投入 37水浴融化) 冻存主要步骤：活性好的细胞，加保护剂(DMSO 等)混合；做好标记(细胞种类、日期等)；逐渐降低温度，最后放至液氮中；降温梯度要合适，总的原则是慢冻生产用动物细胞 原代细胞：费钱费力，少用 传代细胞系：安全，特点： 2n 核型，贴壁依赖，接触抑制，有限传代(50 代) 转化细胞系：自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培养 工程细胞系：融合细胞系(仙台病毒融合法、聚乙二醇融
23、合法、电融合法)；基因工程细胞系 病毒载体：牛痘病毒。腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统 基因工程细胞主要的筛选系统，HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)选择系统，筛选 tk+、 hgprt+的转化细胞GPT(HAT、黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸)选择系统，筛选 gpt+的转化细胞 G418(Geneticin)选择系统，筛选 Neor 的转化细胞MTX 选择系统，筛选 dhfr+的转化细胞细胞库的建立：原始细胞库(MCR)生产用细胞库(MWCR，又称工作细胞库，主细胞库生产细胞库)常用生产用动物细胞：BHK-21，C127 细胞，CHO-K1，COS 细胞，MDCK 细胞，WI-
24、38，MRC-5，Namalwa，Sf-9，Vero， SP2/0-Ag14动物细胞大规模培养 动物细胞的大规模培养方法 悬浮培养 ：适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞优点：操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以借鉴细菌培养的经验。缺点：细胞培养密度较低。 微载体培养 ：用于培养贴壁细胞。充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当(1.030 1.045g/ml)、粒径均一，在 60250m 之间(溶胀后)、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分 多孔载体培养 ：可用于悬浮细胞及贴壁细胞。细胞在网格内，能避
25、免受到剪切力的损伤，因此培养体系可以提高搅拌速度和通气量。多孔载体的一般条件：具备生物相容性、机械稳定性和热稳定性 微囊化培养 ：避免剪切力对细胞造成的损伤；获得较高细胞密度 10710 8 个/ml；利于纯化；可采用多种生物反应器进行培养 中空纤维培养 ：把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟毛细血管提供营养。理想的动物生物反应器必须具备的基本要求： 体系中的各种材料，对细胞必须无毒性。 生物反应器结构的传质、传热和混合性能好。 密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染。 培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一。 可长期连续运转，尤其对于动物细
26、胞而言。 容器加工制造时要求内面光滑，无死角。 拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒。 设备成本尽可能低。 动物细胞生物反应器 规模：实验室规模：100L 类型：搅拌罐式；气升式；中空纤维式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性摇袋式细胞培养 主要操作方式： 分批式操作：能够控制的参数只有 PH、温度和通气量 补料-分批(或流加式) 操作：不断地向系统中补充新的营养成分 半连续式操作 连续式操作和灌流式操作：后者取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。转基因动物 基本原理及步骤：外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细
27、胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系转基因动物制作方法 经典的技术路线 ：基因显微注射法，最常用、成功的方法，成功率低 整合胚胎移植的技术路线：受精卵的成活率高达 90以上，外源基因整合率高，提高受孕率 核移植(克隆)的技术路线：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。 整合卵受精的技术路线：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。 具体方法：基因显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法，精子载体导入法、基因打靶法、人工酵母染色体法 转基因动物研究出现的问题：制作转基因动物效率低；外源基因在宿主基因组中的行为难以控制；转基因表
28、达水平低转基因动物反应器：(bioreactor)目的片段在器官或组织中表达的转基因动物。如乳腺、膀胱、血液等动物细胞产品制造实例：类淋巴细胞干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿性纤溶酶原激活剂-尿激酶原、促红细胞生成素(EPO)、凝血因子 VIII、乙型肝炎疫苗第四章 抗体工程制药概述 抗体工程应用于医学领域：研究，以免疫转印法检测特定抗原；医疗，以毒素连结抗体攻击 病变細胞；检验，以 ELISA 侦测特定病原体；多克隆抗体(polyclonal antibody，pAb)简称多抗。如: 免疫血清(含多种特异性抗体)实际意义：预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清(抗破伤风)；胎盘球蛋白
29、(抗病毒感染)。 副作用： 超敏反应 。 临床诊断，如：肥达氏反应(伤寒、副伤寒)。 缺点：特异性差单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb ) 简称单抗 优势：特异性高：只识别某一个特定的抗原决定簇。 均一性好 ：其 H 链、L 链及 V 区独特性其完全一致，所得到的抗体结构和生物学性状完全一致。杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能无限增殖抗体分子的结构和功能 基本结构: 四肽链结构 重链(H 链)和轻链(L 链) 天然 Ig 分子中，重链同类，轻链同型。重链可分为五类：、 、 链IgM 、IgG 、IgA、IgD、IgE；轻链可分为 、 型。 可变区(V 区 )、恒定区(
30、C 区)和铰链区( 木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 ) VL 、VH 区各有 3 个超变区 (也称互补决定区，CDR 1-3)，共同组成 Ig 的抗原识别部位，形成与抗原决定簇互补的表位。可变区中的其它部分变化较小，称为骨架区(FR) C 区决定 Ig 分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。 抗体分子的价位：指抗体分子能结合的抗原表位数的多少。VH 和 VL 的 CDR 区共同构成抗原的结合位点，因此一个单体免疫球蛋白分子有两个抗原结合点，故习惯将单体抗体分子称为 2 价分子。单克隆抗体的制备 产生杂交瘤细胞的三个关键点：B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性、细胞融合技术、杂交瘤细胞的筛选单克隆抗体制
31、备的基本过程(理解) ：抗体与动物免疫，提取能够产生抗体的 B 淋巴细胞，B 淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒/聚乙二醇的诱导下融合，并在特定的选择培养基下筛选出杂交瘤细胞。在体外条件下做大规模培养/注射到小鼠腹腔内增殖。再提取出大量的单克隆抗体, 最后进行纯化。 抗原和免疫：抗原的制备( 通常和佐剂混合，增强免疫应答) 、免疫动物(体内/ 体外免疫方法；动物的选择：一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物) 细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选 细胞的融合： 制备脾细胞悬液 ：最后一次免疫后三天，110 8 个； 制备骨髓瘤细胞悬液 ：对数生长期细胞，(2 3)10 7 个； 融合 ：40
32、50PEG(MW4000)，37，5min HAT 培养基筛选杂交瘤细胞HAT 培养基筛选原理：H( 次黄嘌呤 )；A(氨基蝶呤)；T(胸腺嘧啶)。骨髓瘤细胞不具备 HGPRT 和 TK，B 淋巴细胞寿命短。 影响细胞 DNA 的合成 ：H 促进了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)途径； T 促进了胸腺嘧啶激酶(TK)途径；内源性途径(谷氨酰胺、鸟核苷酸单磷酸，二氢叶酸还原酶途径)被 A(叶酸的拮抗物)阻断步骤：融合后细胞HAT 培养基 HT 培养基正常培养基 杂交瘤细胞的检测和克隆抗体的检测：仅少数杂交瘤细胞可以分泌预期抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法、放射免疫测定
33、法、流式细胞仪法杂交瘤细胞的克隆：有限稀释法、软琼脂培养法。经过 3 4 轮克隆化，才能达到 100孔内均为阳性细胞克隆。耗时长(3 4 月) 杂交瘤细胞的冻存：冻存原始细胞 单克隆抗体的大量制备：体内接种法( 皮下接种、腹腔接种) ；体外培养法 单克隆抗体的鉴定和检测 单克隆抗体的检测 McAb 特异性检测：检测有无抗原抗体结合；检测有无交叉反应。ELISA、间接免疫荧光法 McAb 类和亚类的鉴定：类的鉴定一般在杂交瘤的克隆化过程中可以确定(兔抗鼠 IgG 或 IgM 作为二抗用于 ELISA)亚类的确定需要用标准抗亚类血清系统做双扩散电泳或夹心 ELISA。 其他鉴定：中和活性鉴定；识别
34、抗原表位鉴定；亲和力鉴定；效价(滴度鉴定)；纯度鉴定 杂交瘤细胞的鉴定：主要是对杂交瘤细胞进行染色体分析抗体治疗疾病的机制：中和作用、导向作用、拮抗作用、ADCC、CD、Aonist抗体在疾病治疗中的应用 作为诊断试剂：病原微生物抗原抗体的检测、肿瘤抗原的检测、免疫细胞及其亚群的检测、激素测定、细胞因子的测定 作为治疗药物：抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反应、治疗自身免疫性疾病和变态反应性疾病制约抗体药物迅速发展的主要障碍：免疫原性；分子量大基因工程抗体 单克隆抗体的人源化 嵌合抗体：人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。 特点：具备亲本鼠源单抗相同的特异性和亲和
35、力；对人的免疫原性大大减少；可以接上不同亚类的人 C 区基因，改变抗体功能；半衰期长；工程细胞系比人人杂交瘤细胞稳定；由于鼠 VL 和 VH 区的存在，仍有较强免疫原性 改形(型)抗体：把鼠抗体的 CDR 序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称 CDR 移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。 ，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变， 小分子抗体 包括 Fab、Fv、单链抗体及单域抗体等 Fab 片段：由重链 V 区及 CH1 功能区与完整的轻链以二硫键连接而成。1/3 Fv 片段：由 VH 与 VL 非共价结合而成。在 VH 与 VL 的适当区域个引入一个半胱氨酸，形成链内二硫键，
36、成为 二硫键稳定的 Fv(disulfide-stablized Fv， dsFv)1/6 单链抗体(ScFv )：在 VH 与 VL 之间加上一段连接肽，把 VH 与 VL 连成一条单链，即单链抗体。常用的 连接肽是 (GGGGS)3 单域抗体：即为 VH 或 VL，约为完整分子的 1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。 优点：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小，穿透力强；不含 Fc，没有 Fc 带来的效应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。 多功能化抗体 双功能
37、抗体(bsAb)：又称双特异性抗体，两个针对不同抗原决定簇的 ScFv 以共价键或非共价键连接在一起。 融合抗体：Fc 抗体融合蛋白；Fv 抗体融合蛋白 细胞内抗体：指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，也称内抗体。在 scFv 的 C 端/N 端插入其他靶向信号 最小识别单位：约为完整分子的 1/80-1/70 大小，一般由一个 CDR 构成，它也保持着抗体的特异性噬菌体抗体工程 噬菌体抗体库技术的三个关键：RT-PCR 技术；噬菌体展示技术；抗体原核表达技术 。 噬菌体抗菌库技术的筛选：。固相或液相纯化抗原的筛选、全细胞筛选、用切片组织进行筛选第五章 疫苗及其制备技术1.活疫苗 (liv
38、e vaccine)选用无毒或弱毒但免疫原性高的菌种，经培养、繁殖后制成的。活疫苗株进入机体后，能继续生长繁殖，对机体呈长时间刺激，持续产生抗体。这类菌(疫)苗有卡介菌(预防结核病的菌苗)、炭疽菌苗、牛痘疫苗、狂犬病疫苗、 鼠疫菌苗、脊髓灰质炎疫苗以及麻疹苗等。2.死疫苗 (killed vaccine)包括灭活疫苗(由完整的病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，即要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性)和 亚单位疫苗(将病原体经物理或化学方法处理，除去无效物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗)活疫苗特点 死疫苗特点 可在体内繁殖 系统免疫反应和局部免疫反应 免疫力持久，产
39、量高，成本低 有毒力增强和反祖危险 不能在体内繁殖，性质稳定，安全性高 有利于制备多价或多联疫苗 比较安全，不发生全身性副反应，无毒力反祖现象 受外界影响小，有利于保存运输 免疫剂量大，需多次免疫，成本高 抗原干扰现象 保存条件苛刻 只能诱导机体产生体液免疫 通常需要用佐剂或携带系统来增强其免疫效果活疫苗 死疫苗 DNA 疫苗 可在宿主细胞中复制 毒力降低 免疫反应比较全面 免疫剂量小 免疫保护期长 不能在宿主细胞中复制 无毒，不返强 免疫反应不太全面 不会传染给其它个体 制备技术相对容易 可刺接抗原在细胞内合成 可诱导细胞免疫 制备技术容易标准化重组亚单位疫苗 将病原的主要保护性抗原蛋白基因
40、在体外进行大量表达，纯化其表达产物辅以佐剂制成疫苗-亚单位疫苗 良好的安全性和稳定性。利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和自然感染的动物 适用于发病快，病程急，中和抗体能有效控制发病的传染病。 不适于病程发展缓慢，潜伏期长，感染巨噬细胞且有 ADE 效应的疾病。活载体疫苗 利用低致病力的痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体，将其它病原的主要保护性抗原基因插入到载体基因组的非必需区形成新的重组体，在同源或兼容性好的启动子驱动下随载体的复制表达插入的外源基因。病毒活载体疫苗的缺点：使用同一载体的不同疫苗不能同时使用疫苗制造流程制造优良疫苗的关键：优良的菌种；适宜
41、的培养方法；良好生产工艺；严格的检验和标准。生产工艺流程：菌(毒) 种培养物(培养基、动 物、禽胚或细胞等)收获抗原(培养液、含毒组织、胚液或细胞液等) 配苗 分装冻干成活疫苗或灭活后制成灭活疫苗。毒种的选择与减毒 毒株须具备的条件：1) 持有特定的抗原性；2) 有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性；3) 易在特定组织中大量繁殖；4) 不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；5) 如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象；6) 未被其它病毒污染。强毒种的选育：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准弱毒种的选育：初选的依据：生物性状改变细菌灭
42、活疫苗制造：种子培养灭活和无菌检查浓缩提高含菌量配佐剂分装动物安全试验细菌弱毒疫苗制造：菌种培养浓缩配苗和冻干动物安全试验病毒性动物组织苗(自家组织灭活苗；病毒弱毒疫苗)、病毒禽胚疫苗、病毒细胞疫苗、寄生虫疫苗的制备 疫苗产品的质量检定：外观检查、pH 值检测、纯度、宿主细胞 DNA 和蛋白残留量、无菌检查、热原、抗生素检测、灭活效果的验证、异常毒性检查、稳定性试验、效力试验(生物效价)、佐剂的质量评价、疫苗标准品或参考品的研究甲型肝炎减毒活疫苗：生产用细胞(人二倍体细胞)、细胞库管理及检定、细胞制备、细胞培养液、毒种名称及来源、种子批的建立、对照细胞外源因子检查、病毒接种和培养、病毒提取(检
43、定合格的病毒收获物经冻融和(或)超声波处理，并采用适宜浓度的三氯甲烷抽提以提纯病毒)、原液(同一细胞批生产的病毒收获物经提取病毒后合并为一批原液)流行性乙型脑炎疫苗：收液作毒力滴定与无菌实验，加入福尔马林，22恒温灭活 8d灭活剂、保护剂和免疫佐剂 灭活剂种类1. 甲醛溶液：最常用。蛋白质 核酸烷基化(不加中断剂)作用于氨基、羧基、羟基、巯基2. 烷化剂：乙酰基乙烯亚胺(AEI)；二乙烯亚胺(BEI) ；缩水甘油醛。 (使微生物核酸烷基化,灭活后加 2%硫代硫酸钠中断灭活)。 烷化 DNA 分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，妨碍 RNA 的合成 。 使病毒完全丧失感染力，而保留其保护性抗原 。3. 苯
44、酚(石炭酸)：用于防腐， 很少用于疫苗研制4. 结晶紫：蛋白质变性( 溶于有机溶剂)；用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原5. -丙酰内酯：病毒灭活剂，主要用于狂犬病灭活苗制备！注意 ：灭活剂对人有害， 有时对皮肤粘膜有强烈刺 激性如：甲醛、 -丙酰内酯影响灭活作用的因素：灭活剂特异性；微生物种类和特性；灭活剂浓度；灭活温度；灭活时间；灭活 PH 值；有机物存在保护剂的用途 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO，一种细胞的保护剂) 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳(或二甲基亚砜)和蔗糖等(不同国家有不同配方) 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖保护剂分类：机理渗透
45、剂(DMSO、甘油和蔗糖) 非渗透剂(聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质)； 分子量大小高分子物质、低分子物质； 化学性质复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物疫苗冻干保护剂组成：营养液；赋形剂；抗氧化剂常用的冻干保护剂(稳定剂) 细菌的保护剂 需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、1.5明胶； 厌氧性细菌：含 1.5谷氨酸钠的乳糖或 10脱脂乳或 7.5葡糖血清。注：脱脂乳： 20脱脂奶粉溶于水配制而成。 病毒的保护剂 5%蔗糖脱脂乳；马立克 814 活细胞疫苗：保存液氮.稳定剂为 10%二甲基亚砜和 50%犊牛血清的 199 液。注 : 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有不同的配方。常用
46、的保护剂：5%蔗糖(乳糖)脱脂乳保护剂 ；明胶蔗糖保护剂； SPGA 保护剂 免疫佐剂： 氢氧化铝胶 (铝胶) 油乳佐剂 乳化剂 白油佐剂 蜂胶佐剂 脂质体佐剂 细胞因子类免疫佐剂(IL-2、IL-4、IL-12、IFN- ) CpG DNA(指含有非甲基化 CpG(胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 )基序的脱氧核糖核酸 DNA) CpG OND(含有非甲基化 CpG 基序的寡聚脱氧核苷酸) 基因工程减毒素(霍乱毒素，CT；大肠杆菌不耐热毒素， LT；破伤风类毒素，TT) 免疫刺激复合物(ISCOM，抗原：糖苷 Quil A：胆固醇=1:1:1)作用机理：抗原递呈；抗原寻的；免疫调节 CpGDNA 对多种
47、免疫细胞有激活作用：引起 B 细胞分化，直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，在 IL-12 协同下激活 NK 细胞，协同刺激抗原特异性 B 细胞和 T 细胞分化 CpGODN 的体内效应与应用：对天然免疫系统的刺激活性(抗感染、抗肿瘤活性)；对特异性免疫反应的调节作用疫苗佐剂(对蛋白质抗原的作用；对 DNA 疫苗的作用)；过敏性疾病治疗第六章 酶工程制药概述 酶是一类具有催化活性的生物大分子，包括蛋白质和核酸一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。 酶的特点：高效性、专一性、反应条件温
48、和、可调节性。酶的分类：六大类，氧化还原酶类(脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、羟化酶以及加氧酶类)、转移酶类、水解酶类(淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶)、裂解酶类(醛缩酶、水化酶及脱氨酶)、异构酶类(消旋酶、顺反异构酶) 和合成酶类(又称为连接酶)酶的来源和生产：直接从动植物获得，即从生物体中分离和提纯；化学合成方法；工业微生物发酵发酵法产酶的优点：微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全。微生物繁殖快，生产周期短，酶的产量高，成本低。微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的高产酶的菌株。研究内容：酶的大量生产和分离纯化；新颖酶的发现、研究和应用；酶的固定化技术和固定化酶反应器；基因工程技术应用于酶制剂的生产；酶分子改造与化学修饰；有机介质中酶的反应；酶抑制剂、激活剂的开发及应用研究；抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶的研究；酶的定向进化研究酶的分离纯化 分离纯化遵循蛋白质分离纯化的一般原则，但又有特殊性：
