1、 冬虫夏草无性型的分子鉴别摘要 从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛抱 Hirsutella sinensis, 采用RAPD-PCR 的分子生物学手段,并利用一定的技术, 筛选出特定引物, 获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组指纹图谱, 两者相似率高达90%, 从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛抱。另外，以rDNA-ITS 区为分子指标, 对冬虫夏草 Cordyceps sinensis 的有性和无性阶段进行比较分析 , 从分子水平证明冬虫夏草的无性阶段是中国被子毛孢 Hirsutellasinensis .关键词: 冬虫夏草 Cordyceps sinensis , 无性型, rDNA
2、-ITS 区, 中国被子孢 Hirsutella sinensis一 传统真菌分类方法的弊端传统真菌的分类、鉴定主要是基于营养体和子实体的形态学特征并结合其生理生化性状的描述。但是真菌形态特征容易受到培养条件和其他因素的影响，而且许多子实体类型经常难以获得，尤其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难，因此传统的分类方法不能满足某些菌种的分类要求。以虫草属为例，该属菌种种类繁多，仅仅清水大典1994年编著的原色冬虫夏草图鉴就已记载了316种。由于该属大多数种采集困难，寄主范围广泛，世代交替的生活史有无性型和有性型阶段，加之传统真菌分类学圄于技术手段
3、的限制，往往造成对虫草结构发育和生理片段资料的不同理解，使得虫草属种的鉴定和分类非常困难，尤其是无性型的鉴定一直是困扰学术界的难题。随着分子生物学的迅速发展，找寻传统形态、生理、生化等经典分类指标之外的基因序列鉴定模式成为解决困难的重要途径之一。二 分子生物学技术在真菌分类中的应用冬虫夏草的有性型和无性型是它的发育中的不同阶段, 它们的是一致的, 形态的不同只是由于的不同表达。RAPD-PCR研究拟采用分析来研究冬虫夏草和它的分离物的的一致性, 以确证冬虫夏草的无性型。另一种方法，为了证明冬虫夏草的无性型的确切种类,采用分子生物学手段, 以rDNA 18S 和5S 之间的转录间隔区( ITS
4、区) 为分子指标, 通过对冬虫夏草及相关种类有性和无性阶段材料的ITS 区序列进行比较分析, 从基因水平对冬虫夏草的无性阶段进行分子鉴定1应用RAPD-PCR 的分子生物学技术鉴定RAPD-PCR的分子生物学方法能够为确定虫草的无性型提供可靠的分子生物学证据。其程序是首先分别提取虫草子座和假定无性型的DNA，再筛选出合适的引物进行PCR 扩增，得到相应的基因组DNA 指纹图谱。如果两者的指纹图谱相似率很高（90 %以上），就可确定分离获得的假定无性型是实际的无性型。李增智等从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢，并利用RAPD-PCR 技术获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组DNA 指纹图
5、谱，两者相似率高达96%，从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢；张云武等通过RAPD 方法分析，认为云南西北部的标本之间可能已经达到种级分化的水平，但在随后的报道中认为青藏高原不同地区的冬虫夏草居群应为不同亚种而不是不同的种。这表明RAPD在确定有性型的种、亚种的变异范围时比较困难。2基于rDNA-ITS的多态性(包括长度多态性和序列多态性)的序列分析，由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反映生物亲缘关系与分类情况，因而成为真菌分类及鉴定研究的热点，目前已广泛应用于真菌的属种间及部分种内组群水平的系统学研究。（1）rDNA_ITS序列结构核糖体DNA（rDNA）是核DNA基因组中
6、度重复簇的一个组分，在真核生物基因组中有100500个拷贝，总长度为713 kb。核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5到3依次为：外部转录间隔区( external transcribed spacer ETS)、18S基因、内部转录间隔区1 ( internal transcribed spacer, ITS1)、5. 8S基因、内部转录间隔区2( ITS2)、28S基因和基因间隔序列( intergenic spacer, IGS)。rDNA在种内由于基因的流动而经常表现出很高的同源性，在种间则保持着各种程度的变异。变异的多少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系
7、的远近。最常见的变异是ITS上的单个碱基的替换，其次是碱基的插入或缺失。与核糖体DNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列相比较，ITS1和ITS2作为非编码区，承受的进化选择压力较小，相对变化较大，在种间表现出较高的差异，可以为研究真菌的分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。 （2） PCR技术与ITS序列扩增在PCR技术发明之前，主要通过分析rRNA的序列来进行系统关系的研究，因而只能分析1条链,对于出现的错误(1%5%)无法解决；同时许多生物在转录后都要进行一些转录后的加工，如剪切、重排、修饰等，因而这种RNA分析不能真实反映DNA的序列。PCR技术使得生物学家能在短时间内大量获取目
8、标DNA，从而直接进行DNA信息的比较。其二，PCR技术的关键要已知目标序列两端的序列，以获得其引物。由于ITS基因序列两端18S和28S序列的高度保守性，基于这一点，White等为真菌rRNA基因的ITS设计了3种特异引物，即ITS1、ITS4和ITS5，用于大多数担子菌和子囊菌，但这些引物也能扩增一些植物ITS区域。Gardes等为真菌和担子菌分别设计了特异引物ITS1-F和ITS4-B。这一工作大大推动了利用rDNA进行真菌分子系统学关系的研究。（3）ITS序列应用的局限性rDNA-ITS序列分析并不是能对所有真菌的属种或组群进行鉴别。究其原因:其一，ITS区序列尽管是可变的，但对于某些
9、物种其可变的程度相对不高，并不足以用来分析其属种或组群间的差异；其二，ITS序列分析结果还受到比对使用的基因库完善程度的影响。因此在基因库中存在的、与待检真菌亲缘关系相近的已知真菌序列缺乏时或rDNA-ITS序列上表现为极小的差异性时，ITS序列分析的应用能力就受到一定的限制。.建议将ITS序列分析结果与传统的真菌形态学鉴定结果(真菌培养特征、镜检特征等)相结合才能正确地对真菌进行鉴定，以防止误检、错检。尽管目前rDNA-ITS序列分析的应用存在一定的限制，但传统的真菌形态学鉴定方法受主观经验与实验条件的影响而使鉴定工作较困难，除非研究机构和专业人士，在基层单位很少具备全面的真菌形态学鉴定能力
10、，而rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定相对更客观、简便、快速，因此以ITS序列分析为代表的分子生物学方法为真菌鉴定(尤其对基层单位真菌鉴定能力的建立)带来了希望，随着PCR RFLP，RAPD，AFLP技术的成熟与原子探针、流动式单分子荧光检测等新技术新方法在ITS序列分析上的运用以及生物信息学的不断完善，相信rDNA-ITS序列分析的应用将会有更大的发展空间。三 分子手段的优点快速的协同进化，适合种及种下水平的分子分类研究。变异以点突变为主，变异位点相互独立。通过两旁rDNA保守序列上的通用引物，可以对广泛的种类进行PCR扩增和测序，作为分类的通用标记。由于多拷贝，需要的样品量少，通过PCR扩增可达到鉴定分析的目的。过去人们都在期望通过虫草属 Cordyceps 的子囊孢子及可能相关的无性型分生孢子的单孢子培养来证明虫草属的无性型 , 但在许多情况下并不能成功 8 . 而现代的分子生物学方法则能解决这一难题开辟了新的途径和提供遗传本质上的科学证据 .
