1、微生物基础试验实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒一、实验目的1、掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握干热天菌、高压蒸汽 灭菌及过滤除菌的操作方法；2、了解培养基的配制原理；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法。二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。干热天
2、菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。三、试剂与器材1、器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH 度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2、试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验内容1、称量溶化调 pH过滤分装加塞 包扎灭菌无菌检查2、干热灭菌：装入待灭菌物品升温恒温摇床降温开箱取物3、高压蒸汽灭菌：加水装物品加盖加热排冷空气加压恒压降压回零排汽取物无菌检查4、过滤除菌：组装灭菌连接压滤无菌检查清洗灭菌五、关键步骤及注意事项1、要严格按配方配制。2、
3、调 pH 不要过头。3、干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。4、高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。5、过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。六、思考题1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么？3、培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么？4、培养基的配制原则是什么？实验二 土壤中微生物分离纯化培养一、实验目的1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；掌握微生物培养方法；2、了解不同
4、的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法。稀释涂布平板法步骤：倒平板制备土壤污水稀释液涂布培养挑菌落。平板划线法步骤：倒平板标记培养基名称划线。三、试剂与器材1、器材 盛 9ml 无菌水的试管、盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。2、试剂 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏 1 号培养基，查氏培养基
5、四、实验内容1、土壤稀释液的制备2、微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法，微生物培养技术五、关键步骤及注意事项1、掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。2、平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。六、思考题1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。2、如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜？并说明理由。 实验三 菌种保藏一、实验目的1、学习并掌握菌种保藏的基本原理。2、掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。二、实验原理微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用
6、的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法三、试剂与器材1、材料 大肠杆菌、青霉菌、放线菌2、试剂 液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95乙醇、10盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰3、器材 无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40 目与100 目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1、2cm) 、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L 形五通管、冰箱、低温冰箱(30)、超低温冰箱和液氮罐等。四、实验内容1、斜面保藏法2、液体石蜡法3、穿刺保藏法4、砂土管保藏法5、冷冻真空干燥保存法五、关键步骤及注意事项1、清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。2、熔封
7、安瓶时防止封闭不严。3、液氮冻存操作应防止冻伤。六、思考题根据你自己的实验谈谈 1-2 种菌种保藏方法的利弊? 实验四 细菌形态观察及单染色一、实验目的1、了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。2、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。3、巩固显微镜(油镜)的使用方法。4、初步认识细菌的形态特征。二、实验原理细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱
8、性染料进行简单染色。三、试剂与器材1、材料 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2、试剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等。四、实验内容简单染色法：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检五、关键步骤及注意事项1、涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，2、水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。六、思考题1、你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环币?2、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?3、如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢? 实验五 放线菌及霉
9、菌形态观察一、实验目的 1、了解放线菌、霉菌形态观察的原理； 2、学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法； 3、初步了解放线菌、霉菌的形态特征。二、实验原理 放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。 霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气
10、生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝) 及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。 插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。三、试
11、剂与器材 1、材料 黑曲霉、青霉和根霉，细黄链霉菌或青色链霉菌，灭菌的高氏 I号琼脂和灭菌的查氏培养基。 2、实验器材 经灭菌的：平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜等。四、实验内容 倒平板接种插片培养镜检五、关键步骤及注意事项 1、倒平板要厚一些，接种时划线要密。 2、插片时要有一定角度并与划线垂直。 3、观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。 4、如果用 0、1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。六、思考题 1、镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？ 2、你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？实验
12、六 革兰氏染色及芽孢染色一、实验目的1、了解革兰氏染色法和芽孢染色法的原理，并掌握其操作方法；2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性；3、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术；4、学习显微镜(油镜) 的使用方法；5、初步认识细菌的形态特征。二、实验原理革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮) 脱色，最后用复染剂(如番红) 复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采
13、用规范的染色方法是十分必要的。芽孢染色法的基本原理，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。三、试剂与器材1、材料：枯草芽孢杆菌 1218h 营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约 24h 营养琼脂斜面培养物2、试剂 革兰氏染色液(结晶紫液、碘液、95乙醇、番红液 )。5孔雀绿水溶液3、实验器材 小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环
14、、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。四、实验内容1、革兰氏染色法 制片初染媒染脱色复染镜检。2、Schaefer-Fulton 氏染色法 制片染色水洗 复染水洗镜检。五、关键步骤及注意事项1、涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，2、乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。六、思考题1、你认为要得到正确的改良的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪一步？为什么？2、现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。3、你的染色结果是否正确？如果不正
15、确，请说明原因。4、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？5、说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？实验七 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定一、实验目的1、观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。2、学习鉴别死活细胞的实验方法。二、实验原理酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。美蓝是一种无毒
16、性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。三、试剂与器材1、材料 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养 2 天左右的麦芽汁( 或豆芽汁)液体培养物。2、试剂 0.05和 O.1吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。3、器材 显微镜、载
17、玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。四、实验内容1、美蓝浸片观察 酵母培养制片染色镜检30 分钟后再镜检2、水-碘浸片观察五、关键步骤及注意事项1、染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。2、用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。六、思考题1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？ 实验八 微生物直接计数法及测微技术一、实验目的1、了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。2、掌握用测微尺测定微生物大小的方
18、法。二、实验原理显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格(见图2344)；另一种是一个大方格分成 16 个中方格，每个中方格又分成 25 个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是 400 个。每一个大方格边长为0.1mm，所以计数室的容积为 0.1mm3。计数时，通常只用 5 个中格内的菌体(孢
19、子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上 25 或 16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成 lml 菌液中的总菌数。若设 5 个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为 M，如果是 25 个中方格计数板，则计算方法为：lml 菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数 25104M=50000N M(个)微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将 1mm 等分为 100 格，每格长 0.01mm(即 10pm)。镜台测微尺并不直接用来
20、测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。三、试剂与器材1、材料 酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母 24h马铃薯斜面培养物。2、实验器材 细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。四、实验内容1、微生物直接计数法 菌悬液制备镜检计数室加样品显微镜计数清洗血细胞计数板2、微生物测微技术 装目镜测微尺校正菌体大小测定五、关键步骤及注意事项1、防止加样空气泡产生。2、调节显微镜光线的强弱适当。六、思考题1、根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？2、某单位要求知道一种干
21、酵母粉中的活菌存活率，请设计 12 种可行的检测方法。3、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？ 实验一 显微镜油镜的使用及微生物基本实验技术一、实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术。2. 了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。3. 掌握微生物实验的操作技能。二、实验内容：1学习油浸系物镜的使用方法。2用油镜观察细菌和酵母菌染色装片。3. 学习微生物实验的操作技能。三、实验材料和用具细菌三型、酵母菌染色装片；显微镜、香柏油、擦镜液、擦镜纸；试管、培养皿、移液管、纱布、棉花等。四、操作步骤（一）显微镜油浸的使用1将显微镜置于平稳
22、的实验台上，镜座距实验台边沿约为 4cm，坐正。2调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约 1mm 左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。3. 低倍镜观察染色装片首先下降镜台，将酵母菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至低倍镜正下方，镜台升至距装片 0.5cm 处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使镜台下降至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。4.
23、 高倍镜观察染色装片眼睛离开目镜从侧面观察，旋转物镜转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心。不要移动装片位置，准备用油镜观察。5. 油镜观察染色装片提起镜筒约 2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油；从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头；将光线调亮，从目镜观察，用粗调节器将镜台徐徐下降(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如末找
24、到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图；再次观察提起镜筒，换上细菌三型染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。6. 镜检完毕后的工作下降镜台，取出装片；清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许擦镜液擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的擦镜液；擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。（二）微生物基本实验技术1用单层报纸螺旋包扎移液管。2用两层报纸包扎培养
25、皿。3用四层报纸包扎试管。4做棉棉塞五、注意事项1使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察。2上升镜台时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边上升镜台的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。3使用擦镜液擦镜头时，注意擦镜液不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。4注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。六、实验报告分别绘制油镜下观察到的三类细菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。七、问题和思考1用油镜便于观察细菌的依据是什么？2使用油镜应特别注意哪些问题？3当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节
26、？油镜的基本原理一、实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术。2. 了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。3. 掌握微生物实验的操作技能。二、实验内容：1学习油浸系物镜的使用方法。2用油镜观察细菌和酵母菌染色装片。3. 学习微生物实验的操作技能。三、实验材料和用具细菌三型、酵母菌染色装片；显微镜、香柏油、擦镜液、擦镜纸；试管、培养皿、移液管、纱布、棉花等。四、操作步骤（一）显微镜油浸的使用1将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为 4cm，坐正。2调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约 1mm 左右。转动反光镜采集光源，光线较强
27、的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。3. 低倍镜观察染色装片首先下降镜台，将酵母菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至低倍镜正下方，镜台升至距装片 0.5cm 处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使镜台下降至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。4. 高倍镜观察染色装片眼睛离开目镜从侧面观察，旋转物镜转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦
28、距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心。不要移动装片位置，准备用油镜观察。5. 油镜观察染色装片提起镜筒约 2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油；从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头；将光线调亮，从目镜观察，用粗调节器将镜台徐徐下降(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图；再次观察提起镜筒，换上细菌三型染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时
29、可比第一次少加香柏油。6. 镜检完毕后的工作下降镜台，取出装片；清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许擦镜液擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的擦镜液；擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。（二）微生物基本实验技术1用单层报纸螺旋包扎移液管。2用两层报纸包扎培养皿。3用四层报纸包扎试管。4做棉棉塞五、注意事项1使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察。2上升镜台时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边上升镜
30、台的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。3使用擦镜液擦镜头时，注意擦镜液不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。4注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。六、实验报告分别绘制油镜下观察到的三类细菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。七、问题和思考1用油镜便于观察细菌的依据是什么？2使用油镜应特别注意哪些问题？3当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？油镜的基本原理实验二 细菌的单染色、革兰氏染色及芽孢染色一、实验目的1. 掌握细菌的涂片技术。2. 掌握细菌单染色、革兰氏染色和芽孢染色技术。3. 初步学习无菌操作技
31、术。二、实验内容1. 学习细菌单染色革兰氏染色和芽孢染色的操作技术。2. 初步学习无菌操作技术。三、实验材料和用具大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌 (Staphylocosccus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)的斜面菌种。吕氏美蓝染色液、革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液、香柏油、擦镜液、无菌水；显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸等。四、操作步骤（一）细菌的单染色1涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄
32、膜，涂布面积约 11.5cm 2。2干燥 将涂片于室温中自然干燥。3固定 手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火 23 次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。4染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。5水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。6干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体7待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。（二）细菌的革兰氏染色1涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取
33、菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约 lcm 的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。2干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。3固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰 3 次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。4初染 于制片上滴加结晶紫染液，染 lmin 后，用水洗去剩余染料。5媒染 滴加卢戈氏碘液，lmin 后水洗。6脱色 滴加 95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需时 30s 至 lmin)，水洗。7复染 滴加石炭酸复红液复染 l
34、min，水洗。8滤纸吸干，油镜镜检。革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。9检测未知菌：用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并记录染色结果。（三）细菌的芽孢染色1方法 1(1)取 37培养 1824h 的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”)。(2)于涂片上滴人 35 滴 5%孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约 45min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用 0.5%沙黄水溶液(或 0.05%碱性复红)复染 lmin，水洗。
35、(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。2方法 2(1)加 12 滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 23 环培养1824h 的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。(2)加 5%孔雀绿水溶液 23 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热 1520min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火 3 次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加沙黄水溶液，染 23min 后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。五、
36、注意事项1载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。2. 涂片务求均匀，切忌过厚；在革兰氏染色过程中，不可使染液干涸；脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌；老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。3供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。六、实验报告1记录实验过程2单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。3记录革兰氏染色法步骤，并进行结果分析；未知菌的检测结果。4绘制枯草芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。七、问题和思考1涂片在染色前为什么要先进
37、行固定？固定时应注意什么问题？2制备染色装片时应注意哪些事项，为什么？制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？3什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?4试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。5为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色?一、实验目的1. 掌握细菌的涂片技术。2. 掌握细菌单染色、革兰氏染色和芽孢染色技术。3. 初步学习无菌操作技术。二、实验内容1. 学习细菌单染色革兰氏染色和芽孢染色的操作技术。2. 初步学习无菌操作技术。三、实验材料和用具大肠杆菌( E.coli)、金黄色葡萄球菌( Staphylocosccus aureus)、枯草芽孢杆菌( Bacillus
38、 subitilis)的斜面菌种。吕氏美蓝染色液、革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液、香柏油、擦镜液、无菌水；显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸等。四、操作步骤（一）细菌的单染色1涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约 11.5cm 2。2干燥 将涂片于室温中自然干燥。3固定 手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火 23 次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。4染色 将涂片置于水平
39、位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。5水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。6干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体7待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。（二）细菌的革兰氏染色1涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约 lcm 的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。2干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。3固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色
40、，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰 3 次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。4初染 于制片上滴加结晶紫染液，染 lmin 后，用水洗去剩余染料。5媒染 滴加卢戈氏碘液，lmin 后水洗。6脱色 滴加 95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需时 30s 至 lmin)，水洗。7复染 滴加石炭酸复红液复染 lmin，水洗。8滤纸吸干，油镜镜检。革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。9检测未知菌：用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并记录染色结果。（三）细菌的芽孢染色1方法 1(1)取 37培养 1824h 的枯草芽孢杆菌作涂片，并干
41、燥，固定(参见“细胞单染色法”)。(2)于涂片上滴人 35 滴 5%孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约 45min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用 0.5%沙黄水溶液(或 0.05%碱性复红)复染 lmin，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。2方法 2(1)加 12 滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 23 环培养1824h 的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。(2)加 5%孔雀绿水溶液 23
42、滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热 1520min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火 3 次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加沙黄水溶液，染 23min 后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。五、注意事项1载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。2. 涂片务求均匀，切忌过厚；在革兰氏染色过程中，不可使染液干涸；脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌
43、被染成阳性菌；老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。3供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。六、实验报告1记录实验过程2单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。3记录革兰氏染色法步骤，并进行结果分析；未知菌的检测结果。4绘制枯草芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。七、问题和思考1涂片在染色前为什么要先进行固定？固定时应注意什么问题？2制备染色装片时应注意哪些事项，为什么？制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？3什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?4试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。5为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染
44、成不同的颜色?实验三 培养基的制备、灭菌及微生物的分离与纯化一、实验目的1. 了解配制培养基的一般方法和步骤；掌握牛肉膏蛋白胨培养基、高氏 1号培养基和马丁培养基的制备方法。2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。3. 掌握严格的无菌操作技术，掌握从土壤中分离微生物的方法。二、实验内容1学习牛肉膏蛋白胨培养基、高氏 1 号培养基和马丁氏培养基的配制。2学习高压蒸气灭菌的操作方法。3学习用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌；用平板划线方法分离微生物。4学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、l
45、mol/L HCl、KNO 3、NaCl、K 2HPO43H2O、MgSO 47H2O、FeSO 47H2O、4.5mL 无菌水 6管，10%酚液，49.5mL 无菌水(带玻璃珠)1 瓶。土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、称量纸、牛角匙、pH 试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯等。电炉、立式高压蒸气灭菌锅、手提式高压蒸气灭菌锅、超净工作台等。四、操作步骤（一）培养基的制备1牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl5g，琼脂 1520g，水 1000mL，PH7
46、.47.6（1）称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。（2）加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。（3）调 pH：检测培养基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。
47、pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。（4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。（5）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。（6）加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管
48、壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用 8 层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。（7）包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。（8）灭菌：将上述培养基于 121.3湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应故人冰箱内暂存。（9）摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度
49、，便斜面的长度不超过试管总长的 1/2。（10）无菌检查：将灭菌的培养基放入 37温箱中培养 2448h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。2高氏 l 号培养基的配制高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉 20g，KNO 3 1g，NaCl 0.5g，K 2HPO43H2O 0.5g，MgSO 47H2O 0.5g，FeSO 47H2O 0.01g，琼脂 1520g，水 1000mL，pH7.47.6。 （l）称量和溶解：先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO47H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在 1
