1、哺乳动物细胞培养生产流感疫苗摘要动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。本文重点是 MDCK 细胞生产流感疫苗的研究
2、以及临床应用现状。研究背景动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄
3、层。由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，19181919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。世界卫生组织数据显示，每年有5%15%的人会感染季节性流感，重症病例达三百万至五百万。抗病毒药物常用作抵抗流感的应急药物。目前，获准用于流感病毒感染治疗的四种药物：金刚
4、胺和金刚乙胺通过干扰病毒颗粒M2蛋白离子通道功能间接抑制病毒复制；扎那米韦和奥赛米韦是神经氨酸酶抑制剂，可以阻止病毒从细胞膜上正常释放。这些药物可以有效抑制流感病毒，但因其可能对人体产生不良反应及可能诱导耐药等缺点，面对大范围长时间的流感大流行，药物往往也无能为力。目前，接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳方式，可有效减少季节性和大流行性流感对公众健康的影响。因此，病毒疫苗的生产受到广泛关注。现有 4 种类型的疫苗应用于预防流感、全病毒疫苗、裂解病毒疫苗和病毒亚单位疫苗，另外还有冷适应流感活病毒疫苗。全病毒流感疫苗的副作用较大，在国外已经不再使用，国内也正逐渐被取代。目前已上市的流感疫
5、苗基本都是使用鸡胚培养制备，国内外使用鸡胚培养疫苗已经有 50 年历史。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的 SPF 级的鸡胚，鸡胚带有潜在的污染可能，而且培养周期过长，不易于控制产量，不利于应对大规模的流感爆发。为此，世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。在诸多的后续产品中，最值得期待的还是使用细胞培养的流感疫苗。1.流感疫苗的生产方法1.1鸡胚培养法自1933年鸡胚培养流感疫苗获得成功以来，鸡胚培养法成为大量获得流感疫苗的主要手段。半个世纪以来，流感疫苗一直在受精鸡蛋(鸡胚)中培育，现已上市的疫苗大都使用鸡胚培养法制备。在生产疫苗的过程中，鸡胚主
6、要用作培养介质，是病毒生长所需的特殊环境。由于疫苗生产工序要求严格，合格的鸡胚除了保证病毒存活外，还应是健康鸡群的受精卵，一般要求产蛋鸡的年龄不超过1周岁；同时，鸡群必须经过定期检测，确保在生长过程中没有任何禽流感等相关疾病；受精卵内也不能存在任何病毒。因此就难免会遇到一些问题，例如：一方面，对鸡蛋要求严格，不是每只鸡蛋都可以用来生产疫苗，只有经过认证的养鸡厂才可以提供此类鸡蛋；另一方面，每只受精鸡蛋一次只能注射一个病毒菌株，但是典型的流感病毒包含三个菌株，因此现有生产方法效率很低。不仅如此，现有方法需要大量的受精鸡蛋。仅为满足美国现有人口，就需要2.7亿只受精鸡蛋，如果要满足中国现有人口，这
7、个数字可能要达到9亿，所以一旦鸡蛋有问题，整个疫苗计划就宣告失败。近年来，高致病性禽流感的暴发告诫人们届时疫苗可能不够用。采用鸡蛋培养病毒，生产多少疫苗必须提前做出精确计划，然而流感暴发时，一般来说人们很难在短时间内购置生产疫苗所需的数百万只鸡蛋。受上述因素的限制，鸡胚供应量一直较小，另外用鸡胚生产疫苗需要消耗大量无特定病原体(SEP级)的鸡胚，且鸡胚有潜在的污染可能，培养周期长，不易控制产量和质量，故不利于应对大规模的流感暴发。因此，需要研究一种可在流感大流行时能替代鸡胚快速、大量生产流感疫苗的细胞培养法。1.2细胞培养法高等哺乳动物细胞可以很好表达修饰大分子的具有生物活性的蛋白产品。目前，
8、哺乳动物细胞表达系统生产药用蛋白的发展速度远超过酵母、大肠杆菌表达系统。动物细胞生物制药已成为疫苗、基因工程药物、抗体药物、蛋白药物等生物制品生产的重要技术。近年来，美国政府和世界卫生组织都积极推进使用细胞培养技术替代鸡胚培养技术生产流感疫苗。利用连续细胞培养系统生产流感疫苗具有操作简单、规模易放大；与鸡胚培养系统相比，细胞培养系统中繁殖的病毒与原流感病毒分离株的匹配度更高；另外，通过细胞培养系统制备流感疫苗可以克服鸡胚生产的疫苗可能引发人体过敏反应的缺点。除此之外，与鸡胚培养法相比，大规模动物细胞培养生产流感疫苗在生产工艺上也有很多优势(表1)。更为重要的是，新的细胞培养法有助于人类灵活应对
9、大规模暴发的流感。因此，在人和动物对流感疫苗需求不断增加的形势下，细胞培养能在短期内提供足够疫苗产品，且能避免鸡胚感染的风险。而且，哺乳动物细胞培养的流感病毒与临床样本更为相似。因此，利用细胞培养流感疫苗已成为目前流感疫苗研制的重要方向。表 1 鸡胚与细胞培养生产流感疫苗的比较生产方式 工艺过程 优点 缺点鸡胚培养法 1.鸡胚培养 工艺成熟 1.可能含有未知污染2.培养候选疫苗株 2.不能应对大规模突发流感大流行细胞培养法1.细胞培养分离候选疫苗株2.检查细胞疫苗的单向免疫扩散试剂3.细胞培养疫苗的制造可规模化、快速大量生产、易于质量控制，纯度高、稳定性好1.需要适宜细胞系的鉴定2.工艺相比鸡
10、胚培养略显不成熟2.MDCK细胞培养生产流感疫苗细胞培养法制备流感疫苗所使用的哺乳动物细胞主要包括MDCK细胞、Vero细胞和PER.C6细胞。哺乳动物细胞具有无外源因子污染、易于规模化生产、抗原稳定等优点，因此培养的流感疫苗具有较好的免疫原性，接种后不良反应轻，较为安全。MDCK细胞在安全性、免疫原性及培养方面具有明显优势。MDCK细胞从犬肾获得，该细胞在平板上培养时会合成的紧密连接蛋白可分泌到表面球状顶部形成单细胞层。MDCK细胞系可以用于多种病毒的繁殖和纯化，如：呼肠孤病毒、腺病毒、犬细小病毒、猫粒细胞缺乏症病毒和禽流感病毒等。迄今为止，很多研究都聚焦于对各种微载体上MDCK细胞生长特性
11、的揭示以及与不同细胞系和卵细胞产毒规律的比较，还有微载体大规模培养系统中MDCK细胞生长和病毒复制过程的代谢规律。在MDCK细胞培养生产流感疫苗过程中存在的最大问题是细胞生长需要血清，由于血清成分复杂，批次质量差异较大，价格昂贵。因此，迫切需要开发MDCK细胞的无血清培养技术。2.1激素替代的无血清培养在细胞培养中，血清的主要作用是提供各种激素，可以用激素代替血清。在培养基中用生理浓度的甲状腺素、促甲状腺激素释放激素、甲状旁腺激素、生长调节素和转铁蛋白代替血清，使垂体细胞株GH3在无血清培养基中生长。MDCK-LP和 MDCK-LPM无血清培养基，能使MDCK 细胞在培养35天后从2104个细
12、胞/cm 2增殖到410 5个细胞/cm 2。无血清低蛋白培养基RPMI/SP ，在经典培养基RPMI1640的基础上添加了750g/mL大豆蛋白水解物、300g/mL谷氨酰胺及抗生素混合液，该培养基可以维持MDCK细胞贴壁的稳定生长，最大细胞浓度可达210 6个细胞/cm 2。但是上述MDCK 细胞无血清培养基只能支持MDCK细胞贴壁生长，大规模培养过程中必须利用微载体等支持细胞贴附的基质，既增加了成本也为后期纯化带来了麻烦。2.2无血清悬浮培养动物细胞悬浮培养体系除了可以突破细胞生长表面限制之外，细胞培养环境更加均一，利于生产规模的放大和监控。因此，开发MDCK细胞无血清悬浮培养系统生产流
13、感疫苗，是采用MDCK细胞生产流感疫苗的必经之路。全球最大的生物制药公司之一诺华公司经过驯化获得的MDCK细胞株33016-PF已经可以进行无血清悬浮培养，且已经放大到1000L的规模。I期临床研究结果表明，采用33016-PF细胞生产的流感疫苗Optaflu和采用传统鸡胚法生产的流感疫苗在安全性和免疫原性上没有显著差异，不同年龄人群的耐受度也几乎一致，而涉及到更多临床样本的II期临床研究显示，Optaflu和鸡胚法生产的疫苗在产生抗体的反应原性效力上也具有可比性，考虑到在获得病毒株后鸡胚生产疫苗的时间需要半年到一年，而细胞培养法只需23个月，细胞培养法相比传统鸡胚法在应对突发大面积流感方面有
14、着明显的优势。诺华在2007年6月宣布，欧盟已经批准其流感疫苗Optaflu上市，其为第一个由细胞培养而非鸡胚生产的疫苗。Optaflu的上市标志着近50年流感疫苗生产史最重大的创新之一。针对2009年流行的H1N1流感病毒，采用与Optaflu类似的由MDCK 细胞生产的单价疫苗的I 期临床研究结果公布，由诺华公司参与研发的H1N1病毒灭活表面抗原仅需一次注射即可产生具有保护作用的抗体滴度，且人体耐受性较好，无严重不良反应。由此可见，以MDCK细胞培养生产流感病毒疫苗的平台已经形成并正在推广。多项研究也证明，哺乳动物细胞生产的疫苗在安全性和免疫性上与鸡胚法相当，而在经济性和时效性上则远远超出
15、，显示了良好的发展前景。总结近年来，因流感病毒侵害，人类健康和动物产品工业每年都要蒙受巨大损失。因此迫切需要开发连续、稳定、大规模且经济有效的疫苗生产方法，以提高流感疫苗的生产效率，降低成本，提高人民的健康质量，改善人民的生活质量。与采用鸡胚培养生产疫苗的方法相比，利用哺乳动物细胞培养技术生产流感疫苗的新方法更快、更廉、更高效，有助于人类预防包括禽流感在内的流感的大规模暴发，具有广阔的应用前景。有理由相信在不远的将来，人类会在与流感病毒的斗争中取得决定性胜利。参考文献1陶源,胡又佳,朱宝泉.基于哺乳动物细胞培养的流感疫苗生产J.世界临床药物,2011,(9).2崔良凤. 用哺乳动物细胞培养流感疫苗的现状J.养殖技术顾问,2009,(4).0931125 金志浩0931224 葛骏彦
