1、ICS65.020.99 B22备 案 号 ： 40457-2014 DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 2571-2013鸡 传 染 性 支 气 管 炎 RT-LAMP 诊 断 技 术 规 程Technical code of detecting RT-LAMP for Infectious Bronchitis2013-12-20 发布 2014-01-20 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T 2571-2013前 言为 规 范 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 RT-LAMP诊 断 技 术 规 程 ， 提 高 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 病 毒
2、检 测 的 灵 敏 度 、 稳 定 性 、 特 异 性 ， 特 制 定 本 标 准 。本 标 准 按 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 要 求 编 写 。 本 标 准 的 附 录 为 规 范 性 附 录 。本 标 准 由 江 苏 省 农 业 科 学 院 提 出 。 本 标 准 起 草 单 位 ： 江 苏 省 农 业 科 学 院 。 本 标 准 起 草 人 ： 刘 宇 卓 、 李 银 、 黄 欣 梅 、 赵 冬 敏 、 韩 凯 凯 、 张 敬 峰 。DB32/T 2571-20131鸡 传 染 性 支 气 管 RT-LAMP
3、 诊 断 技 术 规 程1 范围本 标 准 规 范 了 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 RT-LAMP诊 断 技 术 所 用 引 物 大 小 、 所 涉 及 的 样 品 范 围 、 操 作 流 程 、 反 应 条 件 等 技 术 标 准 。本 标 准 适 用 于 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 的 实 验 室 诊 断 、 临 床 诊 断 、 流 行 病 学 调 查 、 分 离 毒 株 的 鉴 定 。2 规 范 性 引 用 文 件下列文件对 于本文件 的应用是 必不可少 的 。 凡是注 日 期的引用文 件 ， 仅注日 期的版本 适用于本 文件。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其
4、 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 16548-2006 病 害 动 物 和 病 害 动 物 产 品 生 物 安 全 处 理 规 程GB/T 23197-2008 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 诊 断 技 术NY/T 541-2002 动 物 疫 病 实 验 室 检 验 采 样 方 法3 主 要 试 剂 和 仪 器3.1 DNA Marker DL-20003.2 6xLoading buffer3.3 Bst DNA Polymerase3.4 MgSO43.5 DEPC3.6 Betaine3.7 lO XThermoPol buff
5、er3.8 异丙醇3.9 无 水 乙 醇3.10 琼 脂 糖3.11 核 酸 染 料3.12 氯仿3.13 电 泳 仪3.14 电 热 恒 温 水 槽4 引物按 照 GenBank上 公 布 的 鸡 传 染 性 支 气 管 病 毒 （ IBV） 衣 壳 蛋 白 M基 因 序 列 保 守 区 域 ， 应 用 在 线 LAMP primer designing software PrimerExplorer设 计 一 套 引 物 ， 序 列 如 下 ：F3： 5 一 AAGGATTTGGCCCTCGTA一 3； FIP： 5 一 TGTAACACGCCCATCATAATTCCTAAGAAGGGAA
6、ATTTTGGTGAT一 3； BIP： 5 一 CTCATGCTTGTCTTTTTGGAAGTAGCAGTAGTAAATTCAAATCTAAGGTG一 3 ； B3： 5 一 CTGCGGGTCATCTCTAGG一 3。DB32/T 2571-20132ddH20溶 解 成 25Pmo1/ul后 分 装 ， 一 20 冰 箱 保 存 备 用 。5 临床诊断按照GB/T 2 3197-2008鸡 传 染 性 支 气 管 炎 诊 断 技 术 方 法 进 行 临 床 诊 断 。6 采 样 和 样 品 的 处 理6.1 病 料 的 采 集 及 处 理按照NY/T 541-2002动 物 疫 病 实
7、验 室 检 验 采 样 方 法 ， 采 集 病 料 后 ， 于 0 4 冷 藏 保 存 并 立 即 送 检 ， 采 样 过 程 中 样 品 不 得 交 叉 污 。6.1.1 对 于 急 性 呼 吸 道 的 病 鸡 ， 采 集 分 泌 物 ， 对 于 刚 扑 杀 的 鸡 ， 则 采 取 支 气 管 和 肺 组 织 。6.1.2 对 于 肾 型 和 产 蛋 下 降 型 的 病 鸡 ， 应 采 取 发 病 鸡 的 肾 脏 及 输 卵 管 。6.2 样 品 的 处 理取 无 菌 采 集 支 气 管 、 肺 或 者 是 肾 脏 、 输 卵 管 等 组 织 ， 置 研 钵 中 剪 碎 并 研 磨 ， 反
8、复 冻 融 三 次 ， 将 研 磨 好 的 组 织 以 4 12000 rpm/min 离心10 min， 取 上 清 200 L备 用 。 或 者 经 过 鸡 胚 接 种 后 的 尿 囊 液 200 L 备用。7 RT-LAMP7.1 RNA 的 提 取取已处理的 待检样品 ， 以IBV 阳性病毒 为阳性 对照， 以 无菌水为阴 性对照 ， 每管依 次加入Tri zol 600L， 振 荡 混 匀 后 ， 室 温 放 置 10 min， 加 入 氯 仿 200 L， 剧 烈 振 荡 后 ， 室 温 放 置 1 min， 4 12000 rpm， 离心15 min， 取 上 层 水 相 750
9、 L， 加 入 500 L异 丙 醇 ， 混 匀 ， -20 放 置 15 min， 4 10000 rpm离 心 10 min， 去 上 清 ， 缓 缓 加 入 75 %乙 醇 1 mL洗 涤 ， 4 8000 rpm离 心 5 min， 去 上 清 ， 室 温 干 燥 20 min，加入 DEPC水10 L， 使 充 分 溶 解 。 或 使 用 RNA提 取 试 剂 盒 进 行 提 取 。7.2 反 应 条 件FIP引物1.2 L， BIP引 物 1.2 L、 F3引 物 0.15 L、 B3引 物 0.15 L、 Bst DNA poLymerase2 L、 lO XThermoPol
10、buffer 2.5 L、 100 mmol/L MgSO4 1.5 L、8 mmol/L Betaine5 L、 10 mmol/L dNTPs4 L、 RNA酶 抑 制 剂 0.5 L、 RNA模 板 2 L、 反 转 录 酶 1.0 L、 ddH2O 4.8 L， 总 体 积 为 25 L， 瞬 间 离 心 混 匀 。 60 水浴60 m in， 80 灭 活 10 min， 4 保 存 。7.3 RT-LAMP 试 验 结 果 观 察 及 判 定下 述 方 法 任 取 其 一 ：7.3.1 电泳7.3.1.1 取 RT-LAMP反 应 产 物 8 10 L于 1.0 %琼 脂 糖 凝
11、胶 进 行 电 泳 ， 电 压 为 120 V， 时 间 30 40 min， 紫 外 灯 下 观 察 结 果 ， 并 进 行 拍 照 。7.3.1.2 以 阳性 IBV液作为阳 性对照， 以灭 菌水作 阴 性对照 ， 做RT-L AMP,所有 反应产物 同时电泳。 在阳 性对照有梯 状目的条 带， 阴性对 照无条带 的情况下 ， 检 测样品出现 与阳性对 照相同梯 状条带的 判为阳性 ， 即该样品的I BV核酸呈 阳性； 检 测样品未 出现与阳 性对 照相同目的 条带的判 为阴性， 即 该样品 为 IBV核酸 阴 性 。 如 果 阳 性 对 照 无 相 应 的 目 的 条 带 ， 或 者 阴
12、 性 对 照 出 现 条 带 ， 结 果 均 无 效 ， 该 试 验 需 要 重 做 。DB32/T 2571-201337.3.2 显 色 反 应7.3.2.1 在 每 个 RT-LAMP反 应 管 内 加 入 荧 光 染 料 SYBR Green I 0.5 L， 旋 涡 混 匀 ， 肉 眼 观 察 颜 色 变 化 。7.3.2.2 加 入 核 酸 染 料 后 5 10 min进 行 显 色 判 定 。 肉 眼 观 察 反 应 管 ， 当 阳 性 对 照 管 液 呈 现 绿 色 ， 阴 性 对 照 管 液 呈 现 橘 黄 色 时 ， 说 明 染 料 正 常 ， 显 色 反 应 成 立 ，
13、可 以 进 行 其 它 样 品 的 判 定 ， 否 则 ， 显 色 反 应 无 效 。 其 它 样 品 ， 如 反 应 管 中 液 体 呈 绿 色 时 ， 该 样 品 即 可 判 定 为 IBV核 酸 阳 性 ， 呈 橘 黄 色 时 判 定 为 IBV核 酸 阴性。8 结果判定8.1 临 床 诊 断当 鸡 出 现 与 第 5 条 相 符 临 床 表 现 ， 可 以 初 步 诊 断 为 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 。8.2 实验室 RT-LAMP 结 果 的 判 定同 7.3。8.3 诊 断 结 果 判 定根 据 临 床 诊 断 可 以 初 步 判 定 为 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 的
14、 病 例 ， 结 合 实 验 室 RT-LAMP检 测 结 果 ， 当 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 病 毒 检 测 为 核 酸 阳 性 时 ， 即 可 将 该 病 例 诊 断 为 鸡 传 染 性 支 气 管 炎 。DB32/T 2571-20131附录 A (规 范 性 附 录 ) 阳 性 样 品 的 制 备A.1 毒株鸡 传 染 性 支 气 管 炎 病 毒 阳 性 毒 株 。A.2 制备取 已 知 保 存 阳 性 毒 株 ， 用 灭 菌 生 理 盐 水 作 1:50 100 倍 稀 释 ， 接 种 1011 日龄 SPF 鸡 胚 尿 囊 膜 ， 0.1 mL/枚 。 置 37 恒 温 箱 继 续 培 养 ， 每 天 照 蛋 观 察 3 次 。 弃 去 24 h 前 死 亡 胚 ， 无 菌 收 获 4896 h 死 亡 胚 及 活 胚 尿 囊 液 ， 12000 g 离心 10 min， 吸 取 上 清 分 装 到 1.5 mL 离 心 管 中 ， 每 管 200 L， -20 保 存 ， 备 用 。
