1、1 Leica 激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013 年 3 月 2 目录： 1 系统的组成 系统组成 .3 光路示意图 .4 2 系统的使用 2.1 开机顺序 .5 2.2 软件 界面简介 .7 2.3 在显微镜下观察样品 .8 2.4 采集共聚焦图像 .9 2.5 XYZ三维扫描（ Z-Stack） 11 2.6 时间序列扫描（ Timeseries or xyt Scan） 15 2.7 波长扫描（ xy Scan） 16 2.8 HyD检测器 .17 2.9 图像的保存及输出 .18 2.10 关机 .20 3 系统的维护 .21 3 L
2、eica SP8 系统组成图 4 1 可见波长激光或白激光 15 UVIS, HIVIS或 VISIR的 光路 镀膜 2 声光 调制器 （ AOTF） 16 扫描 视场旋转镜 （ Abbe-Konig 旋转） * 3 红外激光（ IR） * 17 在 NND位置上的反射光检测器（ RLD） * 4 电光调制器 18 物镜 （ 可提供各种选择 ） * 5 紫外激光 * 19 在 NND位置上的透射光检测器（ TLD） * 6 AOTF或直接调制器 （ DMOD） 20 正方型针孔 7 STED 激光 * 21 Fluorifier盘 * 8 Setlight监控二极管 22 X1出口接口 * 9
3、 AOBS, 及其他选 配 件 23 外置检测器 * 10 用于 FRAP的光束增强镜 * 24 色散棱镜 11 红外激光耦合 25 分开的荧光光谱 12 与 CS2紫外光路耦合的紫外激光 26 最多 5个光电倍增管或 4个 HyD检测器 13 STED激光耦合 *选配组件 14 全视野扫描 镜 及 串行高速 扫描 镜 选 件 5 2 系统的使用 2.1 开机顺序 （硬件标号请参考前面的系统组成图） （ 1） 因为 FSU 和 CSU 硬件的电源控制 ）不同，请分别按照如下步骤开机： FSU 系统 CSU 系统 依次打开 “ PC Microscope”、“ Scanner Power”、“
4、Laser Power”三个按钮，将“ Laser Emission”上的激光开关钥匙旋至“ On-1 注意：显微镜控制器的开关 一般是 常开的，在打开 “ PC Microscope” 按钮后指示灯应该点亮，如果不亮，请打开其开关。 先按电脑主机上的电源按钮启动电脑，再打开显微镜控制器 的开关，然后 依次打开 “ Scanner Power”、“ Laser Power”两 个按钮，将“ Laser Emission”上的激光开关钥匙旋至“ On-1 之后 两个系统 的操作一样 （ 2） 打开荧光激发光源 （按绿色的 Power 按钮，如右图） 光源亮度调节旋钮 光闸 Power 按钮 6
5、（ 3） 电脑进入操作系统界面后 ， 双击电脑桌面“ LAS AF”图标启动共聚焦操作软件。 （ 4 ） 进 入 配 置 选 择 界 面 后 ， 在“ Configuration”下拉菜单中选择需要的配置 ； （其中带有“ simulator”字样的为模拟方式，该方式不控制显微镜硬件，不能拍摄图像，适合处理数据） “ Microscope”菜单中选择显微镜型号； （图中 “ Resonant”选项 为快扫功能，可按需要 打开或关闭 ，只有配备了快扫功能的系统才会显示该选项） ，点击“ OK” ，系统继续启动。 （ 5） 在“ Initialize Stage”提示界面选择是否初始化载物台 （
6、如果选择“ No”，则 Tile scan、Mark&Find 和 Matrix 功能不能使用 ） 。 注意：如果配置的是手动载物台，则不会跳出该提示界面。 （ 6） 系统自检完后，进入 LAS AF 操作界面 ，点击界面最上方“ Configuration”按钮进入配置界面点击左边“ Laser Config”按钮打开所需激光 （ OFF ON） ， Argon 激光还需拖动右方滑块以调节激光输出功率 7 2.2 软件界面简介 功能界面切换：参数设定（ Configration）、扫描取图（ Acquire）、图像处理（ Process）、定量测量（ Quantify） 工具和文件管理界面切
7、换： Experiments 界面下显示当前拍摄和打开的图片，Acquisition 下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数 拍摄参数：包括图像 像素 Format、扫描速度 speed、图像放大 Zoom factor、视野旋转Rotation 等 。 三维扫描工具组 ，用于设定和显示三维扫描的 Z 轴范围，及其他辅助设定 光路 显示及 设置区域 ，从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置 图像显示窗口 预设光路选择按钮 激光控制栏 分光镜 选择按钮 物镜选择按钮 预览按钮 ，可用于开始和停止预览 拍摄 图像按钮 叠加图像显示按钮 ，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于
8、显示所有通道叠加后的图像 界面缩放调节滑块 ， 左右拖动可以调节界面项目的显示比例 界面调整 栏，左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围 8 2.3 在显微镜下观察样品 2.3.1 选择 物镜 ： 可通过显微镜主机 右侧 的物镜转换按钮，或软件中的“ Objectives”按钮 进行选择 （如下图） 。（ 在 显微镜设置软件 Leica AF Hardware Configurator 中可设定最下方的 红圈中的 按钮为干 /油镜转换 ，在 干 /油镜 之间切换时需要先按一下此按钮才能完成转换 ） 2.3.2 明场观察： 将样品置于载物台上，按显微镜 左侧 的 TL/IL 按钮打开明场
9、光路 （如右图） （因显微镜所处状态不同，有时候需要按两次才能打开）， 在明场条件下选择合适的视野。通过调焦按钮或旋钮调节至合适的 z 轴平面，通过显微镜主机左侧的“ INT”功能键调节光强。 如果是电动载物台，需通过遥控手轮调节载物台的运动以选择合适的视野（如下图）。 2.3.3 按显微镜前面板的荧光 滤块 选择按钮切换至荧光观察光路（如右图所示 ） ， 其上的 标注 与荧光颜色的对应关系为： I3 -绿色， N2.1-红色， A蓝色， 有些配置的显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不同，请以实际情况为准 。 再按荧光光闸按钮（ SHUTTER）打开荧光，进行样品的荧光观察。 2.3.4 观察
10、完毕后，按显微镜前面板上的9 “ SHUTTER”按钮以保护样品 2.4 采集共聚焦图像 2.4.1 光路 设置： 调用已有的设置：选择“ Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置 ， 激光 波长 及其输出功率、分光镜、检测波长范围、 检测器 gain 及 offset 都会自动设置 ， 包含几种最 常用的荧光染料。选择某一设置后，可按样品的实际情况对参数进 行优化 （ 如后述 ） ，并以新的名称保存。 （如右图） 修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选 PMT、调节 PMT 检测范围、 调节 PMT 的 gain 或 offset
11、等。如 下 图 。 建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、适宜的分光镜、 检测器 及检 测波长范围。 10 分光镜选择原则： 根据所用激光波长来选择合适的分光镜。 1 405 激光选择 Substrate； 2 其他可见波长的激光 根据其波长 选择 分光镜，如 488 激光可选择 DD488/552、TD488/552/638 分光镜。 3 RT 15/85 分光镜所有波长激光都可用，但是会损失 85%的激光能量和 15%的荧光能量，一般在 当现有分光镜无法满足当前激光谱线组合或 进行光谱扫描的时候选用。 Sequential Scan:若染料的发射光谱有重叠， 为减少
12、串色， 成像时每种染料要单独激发，或者说，每次只用一种激发光激发，并只检测一种染料。可用 Sequential Scan来实现。 （如右图）激活 Sequential Scan 功能，可在下面的 Seq 中分别设置各个染料的激发和检测光路。 2.4.2 选择扫描模式 默认模式为 xyz 扫描，是最常用的扫描模式，可用于 xy 扫描和z 轴层切 （ xyz 扫描 ） 。还可在下拉菜单中选择由 x， y， z， t （ 时间 ）以及 （ 波长 ） 组合而成的多维扫描模式， 如 xzy， xyt， xy， xyzt，xyz， xyzt 等 。 2.4.3 设置扫描参数 包括分辨率 （ format）
13、 、扫描速度 （ speed） 、针孔大小 （ pinhole） 、线平均 （ line average） 、面平均（ frame average） 、累加（ accumulation） 及放大倍数 （ Zoom）等 。 （如右图） 分辨率：默认值为 512 512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。 扫描速度：默认值为 400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。可选择双向扫描 （ Bidirectional X） 来达到更高速度，这时可能需要进行相位校准 （ Phase correction） 。 针孔大小：默认值为 1AU。 如果增
14、大针孔直径，可 增加信号强度， 但是所获取图像的 共聚焦效果会降低， 光切厚度也会随之增加。 平均：用于降低背景噪音。分为线平均 （ Line average） 和面平均 （ Frame average） ， 可在下拉菜单中选择平均的次数。 11 累加：仅用于荧光非常弱的样品 2.4.4 预览图像 点击 软件 Acquire 界面左下方的 “ Live” 按钮 以预览图像 （下图） ，图像将显示在右侧的显示屏上 。 预览开始后，“ Live”按钮变为“ Stop”， 点击“ Stop” 按钮 可停止预览。 注意： 一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应快速操作，尽量减少预览的时
15、间。 建议：点击 Live 按钮之前，可调节 format 至 512 512， speed 至 600Hz以获得较快的刷新频率。 预览应达到以下目的： 1 找到最适合观察的焦平面； 2 使图像亮度动态范围达到最佳 。 可通过调节控制面板的“ Z Position”旋钮找到最适合观察 的 焦平面（如下图）； 或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮 （见第 8 页图） 。 图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第 9 页图）、 Smart Gain 和Smart Offset（见上图）。 参数的调整原则： （ 1） Smart Gain 的调节： 增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均
16、减小。一般情况下， Gain 值的正常范围为 5001000； （ 2） Smart Offset 的调节： 可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣除。原则上，在保证图像质量的前提下， Digital Offset 值越接近于 0 越好 ； （ 3）另外，对于每个通道，需要灵活调节激光的强度： 激光强度越高，则信号越强，同时标本更容易被漂白或淬灭。 当 PMT gain 值高于 800 或 HyD gain 值大于 100%时荧光图片亮度还是不够时，可以考虑适当增加激光强度 。 在做活细胞或者光切时，应尽量减少激光强度 ， 原则上，在保证图像质量的前提下，激光强度越低越好 。 12 图像亮
17、度动态范围的判断方法 ： 理想的荧光图像中应该只有少数像素点达到饱和 ， 可通过位于图像左侧的LUT按钮进行观察。 LUT 按钮 （下图红圈） 可在 LUT （ 即指定的荧光颜色，也称伪彩 ） 、“ Glow Over Under （ GlowOU） ”和 灰度图 三档之间切换。在 GlowOU 模式中，灰度值 达到饱和 的像素点显示为蓝色，而灰度值为 0的像素点显示为绿色。调节 Smart Gain使图像中仅少数像素点呈蓝色， 调节 Smart Offset来降低图像的背景。荧光图像 Smart Offset的默认值为 0%，通常应将其调为负值以使图像背景呈绿色。 下 图 中 B图 亮度及背
18、景值设置均未达最优化值，调节 Smart Gain和 Smart Offset后，达到 C图 中的效果，部分信号呈蓝色，而背景呈绿色。 对于 HyD检测器，其背景噪声很低，无需通过 调节 Smart Gain来降低背景。 对透射光图像，同样可以调节透射光 PMT 的电压和偏移值来进行优化，有时可将 Smart Offset调至高于 0%以增加对比度。 如果启用了 Sequential Scan，在应该在每个 扫描序列（ Seq） 分别 通过预览来调整图像亮度。 2.4.5 采集图像 对于单通道染色，或多通道染色同时扫描，单击“ Capture Image” 按钮 采集图像。对于序列扫描，或多维
19、图像扫描，单击” Start” 按钮 进行图像采集。 （ 见下 图） 在此之前可改变扫描分辨率、线 /面平均次数等扫描参数。 扫描分辨率的设置原则： 通常情况下，采集图像时，为充分利用物镜的分辨能力， 可直接点击“ Optimize xy Format”按钮（如下图），由系统自动设置最佳分辨率。 13 根据 Nyquist 采样原则，像素点大小 （ Pixel Size） 应为物镜侧向分辨率 （ 即xy 平面分辨率 ） 的 2/51/2。物镜分辨率可 点击物镜参数表按钮从弹出的 界面读取 ， 像素点大小可在采图参数设置界面获得。像素点随扫描分辨率增大和放大倍数 （ zoom） 增加而减小。 与
20、高倍物镜相比，低倍物镜需要更高的扫描分辨率 。 2.5 XYZ三维扫描（ Z-Stack） xyz 扫描模式为默认采图模式 ，加上 Z轴扫描多个层面，适合观察样品中目标的空间分布。 现有的 LAS AF软件 3.0和 3.1版本 Z-Stack的设置界面不同（如下图所示），但是基本采图流程类似。 2.5.1选择 Z轴驱动方式 根据不同的系统配置，可以点击 Z轴驱动方式按钮 选择“ z-Galvo”或者 “ z-Wide”方式： “ z-Wide” ：使用显微镜固有的 Z轴调节方式，倒置显微镜调节物镜的升降，正置显微镜调节载物台的升降 ，可通过显微镜镜体的调焦旋钮和遥控手轮的调焦旋钮控制。 “
21、z-Galvo”：使 用 选配的 SuperZ进行 精细的 Z轴调节，只能通过控制面板的“ Z Position”旋钮控制。 2.5.2 设置 光路 参数 ，方法同前。 2.5.3 设置 Z轴范围 点击“ Live”进行图像预览 ， 调节 z 轴至层切所需的起点，点击扫描起始设置按钮 定义层切起点 ， 调节 z 轴至层切所需的终点， 点击扫描结束设置按钮定义14 层切终 点 ， 点击“ Stop”终止图像预览。 2.5.4 Z轴参数调整 此时 xyz 层切菜单中显示的“ z-step size” （ 相邻两个光切面的间距 ） 和“ Nr. of steps”（ 层切数目 ） 为系统的优化值 （
22、 “ system optimized” ） 。也可点击“ Nr. of steps”左侧的按钮，然后对相邻光切面间距或层切数目进行自定义。 2.5.4 采图 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击” Start”进行 xyz 图像的采集。 采图完毕后， 3.1版本的 点击 清除已设位置按钮， 3.0版本的分别点击扫描起始和结束位置设置按钮，使其变为灰 色， 使 Z轴位置 重新处于未定义状态 ，以免影响下次采图 。 2.5.5 3D展示 拍摄完 3D图像之后，在图像显示窗口右侧会多出 3个用于 3D图像显示的按钮： 最大亮度投影按钮（ Maximum projection） : 将所有 Z平面的图
23、像信息选取最亮的 点集中 显示在一层，相当于将多层图像压成一层，多用于集中显示跨越多个层面的结构信息。 正交剖面方式按钮（ Orthogonal section） : 分别以 XY、 YZ、 XZ三个方向显示指定位置的剖面 信息，如下图 ，多用于观察结构在 3D空间内的定位。 3D立体模式按钮（ Open in 3D viewer） : 打开 3D可视化模块， 以直观 方式展15 示 3D结构，如下图，该模块功能强大，有多种参数可以调整显示方式，亦可以将所观察到的图像输出成视频。 2.6 时间序列扫描（ Timeseries or xyt Scan） 时间序列扫描多用于活细胞成像，记录动态过程
24、。 2.6.1 在“ Acquire”菜单栏的“ Acquisition”中选择 xyt 扫描模式后，将出现 xyt 扫描菜单，如 右图 。 2.6.2 设置 光路 参数，方法同前。 2.6.3 定义“ Time Interval”，即采集相邻两帧图像所需的时间间隔，也可选择最小值“ Minimize”。 2.6.4 按采图需要选择“ Acquire until stopped”、“ Duration”或“ Frames”。 若选择“ Acquire until stopped”，则图像将持续采集，直至手动终止。 若选择“ Duration”，可定义采图所需的总时间。 若选择“ Frames”
25、，可定义所需的图像帧数。 2.6.5 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击“ Start”进行时间 序列图像的采集。 16 2.7 波长 扫描（ xy Scan） 波长扫描常用于自发荧光或新染料发射光谱的检测 ，如果有串色严重的标本需要进行“ Spectrum Dye Seperation”，必须进行波长扫描 。 2.7.1 在“ Acquire”菜单栏的“ Acquisition”中选择 xy 扫描模式后，将出现波长扫描菜单， 同时检测通道变为如下方式： 2.7.2 选择 合适的激发光和分光镜 。 2.7.3 定义“ Detection Begin” （ 需检测的发射谱起点 ） 和“ Dete
26、ction End”（ 需检测的发射谱终点 ） 。起点所在波长应大于激发波长。 2.7.4 定义“ Detection Band Width” （ 接收的带宽 ） ，通常为 10nm。 如果图像较暗，可以增加带宽，但是光谱数据的精度会降低。 2.7.5 定义“ No. of Detection steps”（ 采集的帧数 ） 或“ -Detection Stepsize”（ 波长步进 ） 。波长步进不应大于接收带宽。 2.7.6 选择所用 PMT检测器（或 HyD检测器） 。 2.7.7 选择合适的分辨率和扫描速度，点击“ Start”进行 发射 波长图像的采集。 2.7.8 扫描结束后，可保
27、存发射光谱信息。操作路径为： 17 “ Quantify Tools Stack Profile” ，如下图： 在图像窗口的右下角，拖动波长滑块，显示的图像会随之变化，选取有典型结构的一张； 在图像窗口上方选项画图工具，圈一个典型区域，中间的 Graphs窗口即显示出该区域的发射光亮度随波长变化的曲线 （上图中的绿色曲线） ； 在上图所示位置点击鼠标右键，弹出的选项中有一个“ Export to Dye Data Base”的选项，点击，弹出命名新染料的对话框； 输入染料名称、激发波长（最大发射波长系统会自动计算出，也可以自己修改）、备注信息等，点击“ OK”，新染料数据即被存入系统的染料数据
28、库。 可以通过“ Configuration/Dye Database”去查看，加入数据库的染料可用 于以后采图的参考。 2.8 HyD检测器 HyD检测器 是高性能的检测器，比 PMT更灵敏响应速度更快，并且有更多的功能。 HyD检测器有三种操作模式可供选择： Standard：标准模式， 跟 PMT一样，检测到的信号直接显示为图像，可通过调节 SmartGain来调节图像亮度。 Counting：光子计数模式，以每个像素点所检测到的光子数显示为该像素点的亮度，此时检测器的 Gain为一个定值， 通过长时间的检测使图像显现出来。常用于非常弱的荧光样本的成像。使用此模式采图时，需使用 累加 （
29、 accumulation）功能来使采集到的图像达到合适的亮度。 BrightR： 如果 视野 中有非常亮的结构，但是又需要 将 较暗的结构显示出来时，18 适合用此模式，此模式会在较为暗的部分使用稍多一些的动态范围，如 右 图。 注意： HyD检测器非常灵敏，如果收集到过强的光信号会影响其寿命，系统有一个安全机制对此进行保护，如果信号过强，会先有声音报警，如果操作者未采取措施，会自动关闭检测器，同时弹出如下的提示窗口： 此时应点击“ Stop”停止预览，降低激光功率，调低 SmartGain值，重新预览。 特别注意 ： 1 使用 HyD成像时，一开始激光功率 不要 设置太高，应从低开始慢慢增
30、加； 2 不要 用 HyD检测反射光，因为一般情况下，反射光亮度要大大强于荧光。 2.9 图像文件的保存及输出 2.9.1图像文件的操作： “ Acquire”的” Experiment”下显示采集的所有图像文件名称， 默认本次开机后采集的所有图像都放在一个文件夹下， 右键点击文件名，可进行多种操作。如 下 图 ： 19 选择“ Save Experiment”即可将当前文件夹下的所有图片保存为一个文件，文件保存格式为 *.lif 原始文件，只能通过 Leica LAS AF、 LAS AF Lite 或其他专业图像数据处理 软件打开 。 2.9.2图像文件的输出 ： 右键点击图像文件名，选择
31、 ”Export”进行图像输出，可输出成图片 （ .tiff 或 .jpeg） ，三维或多维图像还可输出成电影 （ QuickTime、 .avi、MPEG-4、 WMV等 ） 。如 右 图 。所得文件可用普通 图像浏览软件打开。 选择” As Tiff”或” As JPEG”，出现如 下 图的对话框，可选择输出路径、所需标尺及位置等。确定后，点击” OK”，即可将图像输出至指定路径。 20 2.9.3图像采集参数的观察及恢复 ： 右键点击图像文件名，选择” Properties of”，即显示该图像采集时的所有参数设置信息，如图 8-5。 点击” Apply Settings”，即可恢复该图
32、像采集时的参数设置。点击” Save as.”，可将所有参数信息输出成 .xml文件并存至指定路径。 2.10 关机 （ 1） 保存已采集的图像。 （ 2） 在 LAS AF软件 Configuration”“ Laser Config” 界面关闭所有激光。 （ 3） 关闭显微镜荧光电源。 （ 4） 若使用过油镜，需用无水乙醚与无水乙醇混合液 （ 体积比 7： 3） 或无水乙醇清洁镜头。 （ 5） 关闭 LAS AF 软件。 （ 6） 将电脑桌右侧“ Laser Power”按钮右侧的激光开关钥匙 （ Laser Emission）逆时针旋转 90度至“ On-0”位置。 （ 7） 关闭“ S
33、canner Power”按钮。 （ 8） 在电脑上进行图像数据的输出。 （ 9） 关闭电脑后，关闭“ PC Microscope”按钮（ CSU系统需关闭显微镜控制器开关）。 21 （ 10） 风扇停止后 （ 关闭激光开关钥匙约 5分钟后 ） ，关闭“ Laser Power”按钮。 （ CSU系统可直接关闭 “ Laser Power”按钮 ，无需等待风扇停止）。 记录关机时间、仪器状况等信息。 3 系统的维护 （ 1） 保持室温为 18-25 ，相对湿度 40-60%，尽量保证室内环境的清洁。 （ 2） 严格遵守激光器的开、关流程。 （ 3） 如荧光光源为汞灯，则打开电源后 需等 10-
34、15min方可使用；如荧光光源为金属卤素灯，则打开电源后可直接使用。无论哪种灯作为光源，打开后 20min以上才能关闭。 （ 4） 如需用到“ Mark and Find”、“ Tile Scan”、“ Matrix”等要求载物台精确定位的功能时，在启动软件后选择进行载物台初始化，否则也可不做初始化。在初始化过程中，载物台会向四周运动，因此需保证周围没有物品阻碍其运动。 （ 5） 若使用过油镜，需用蘸有无水乙醇的擦镜纸清洁此物镜；若使用过水镜，也需用干擦镜纸轻轻吸干上面的水渍。 （ 6） 关机前，尽量将当前物镜转换为低倍物镜并调至最低位，可最大程度保护物镜。 （ 7） 输出数据时，使用光盘刻录数据而非移动存储设备可更好的防止电脑中毒。 （ 8） 避免空调直接对着显微镜吹风。 （ 9） 拍摄图像时，应避免震动、环境光线、手机信号等的干扰。 如欲了解 LEICA SP8的更多详细应用， 可按在软件界面按“ F1”键，点击界面上出现的“？”圆形按钮打开帮助系统 。 也可 浏览以下网站 ： http:/www.leica-
