1、北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 激光扫描共聚焦显微镜 （ A1R-si） 操 作 指 南 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 1 - 目 录 第一章： T i -E 显微镜操作 2-7 显微镜光路调节和照明注意事项 6 Ti-E 物镜， DIC 插片， DIC 棱镜对照表 7 第二章： 共聚焦 开关机 8-10 第三章： 共聚焦 图像拍摄 1 1 -38 NIS-Elements C 软件开启和操 作界面简介 1 1 -15 NIS-Elements C 的实时图像获得基本操作 16-23 图像拍摄 24-27 探测模式（标准探测器）设置 28-38 第
2、四章 : 图像 的保存和查看 39-42 第五章： 图像分析 43-46 附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍 47-51 附件二：图像格式批量转换操作 52-53 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 2 - 第一章 Ti-E 显微镜 操作指南 （一） 认识显微镜各个部件 （ 1） 滤光片：包括 D-毛玻璃； NCB-色温平衡片； ND-减光片； “ GIF” -绿色滤光片和用于 P F S 的红外滤光片； （ 2） 视场光阑； （ 3） 聚光器升降旋钮； （ 4） 起偏器（ D IC 用）； （ 5） 聚光器对中旋钮； （ 6） 孔径光阑； （ 7） 聚光器模块（包括明视场
3、， D IC） ； （ 8） 滤色块转盘（包括 D IC 检偏器）； （ 9） 手动荧光光闸； （ 10） 电动焦距调节旋钮； （ 11） ND 减光片； （ 12） 遥控器； （ 13） 透射光电源； （ 14） 汞灯荧光光源； （ 15） P F S 控制器 （ 16） HUB 控制器 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 3 遥控器示意图 (根据具体配置有些图标可能不显示 ) 1） 物镜切换按钮； 2） 滤光块， D IC 检偏器切换按钮； 3） D IC 检偏器快速切换按钮； 4） 光路端口切换按钮； 5） P F S 开关控制按钮； 6） 聚光器转盘切换按钮； 7） 透
4、射光源控制按钮 *。 *请注意： CNTL 按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定； CNTL 功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制透射光源。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 4 前面板示意图 1） 状态显示屏； 2） P F S 开关按钮 和 P F S 聚焦状态指示灯 （需要选购 P F S 部件） ； 3） 光路端口切换按钮； 4） 中间变倍旋纽； 侧面板示意图 1） 调焦旋钮 2） 粗微调切换按钮 3） 物镜切换按钮； 4） 滤光块， D IC 检偏器切换按钮 5） 透射光光源开关（当遥控器透射光
5、源控制按钮打开时，此按钮无效）； 6） 透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）； 7） 物镜复位； 8） 物镜向下移动 2 毫米； 注意： 在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色 HU B 控制器（显微镜示意图 15 位置）右 侧的电源开关打开。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 5 （二） 明视场透射光操作要点 1） 打开 电源开关，并打开显微镜透射光卤素灯 电源开关； 2） 把滤色块移到空位； 3） 把起偏器，检偏器移出光路； 4） 把聚光器转盘切换到 A 状态； 5） 检查柯勒照明（柯勒照明调节方法参看附录 1） ； 6） 检查出光端口。
6、 （三） 微分干涉 (DIC)操作要点 1） 按照明视场透射光观察方法调节好显微镜； 2） 把起偏器，检偏器移入光路； 3） 按照相对应物镜将聚光器镜转盘转到相应 N1/N2 位置（请参见另外所附对照表）； 4） 检查出光端口； 5） 旋转起偏器，选择最佳显示效果 。 （四） 荧光观察操作要点 1） 打开荧光电源 稍待片刻至光源指示灯不闪 ； （ 打开约 10min 稳定，关闭需要超过 15min后才可以再次启动 ） 2） 确认透射光开关处于关闭状态； 3） 检查出光端口； 4） 选择合适的滤色块； 5） 打开光闸（ 汞灯面板的 shutter 旋钮 ），调节荧光亮度 （ 汞灯面板的 ND 旋
7、钮 ） ， 进行观察； 6） 不观察时，把光闸关掉 ，以避免荧光淬灭 。 注意：该系统配置透射和荧光光闸，在做相应操作时，应将对应光闸打开。光闸开关可在遥控器上设定。 落射光照明光闸按钮 汞灯光闸按钮（电动型号） 透射光闸按钮 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 6 显微镜光路调节和照明注意事项 （一） 柯勒照明的调节方法 1） 选择 10X 物镜； 2） 调焦，使标本清晰成像； 3） 缩小视场光阑 （显微镜视图 2 位置） ； 4） 上下调节聚光器 （显微镜视图 3 位置） ，使视场光阑边缘清晰； 5） 调节聚光器对中旋钮，使其居中； 6） 放大视场光阑，使其刚刚外切于 视野
8、。 （二） 长寿命 汞灯电源的注意事项 1） 电源打开以后， 大约 10 分钟左右光源达到稳定 状态； 2） 电源关闭以后，至少要等 10 分钟才能重新打开。 （三） 物镜盖玻片矫正环的调节方法 1） 调焦，使图像相对最清楚； 2） 把矫正环向一个方向转动一定角度，此时图像变模糊，调焦，使图像相对最清楚； 3） 判断此时的图像质量是否有所改善。如有改善，则按照该方向再旋转一定角度；如质量下降，则反方向旋转； 4） 重复 2）和 3）直到图像质量改善之后又有所下降； 5） 反方向旋转，回到倒数第二次的位置即可 。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 7 Ti-E 物镜， DIC
9、插片， DIC 棱镜对照表 Ti-E: Combinations of objective and DIC prism Objective DIC Slider N1/N2 Plan Apo 10 10 N1 Plan Apo VC 20 20 N2 Plan Apo 40 40 N2 Plan Apo VC 60 60 I N2 Plan Apo VC 100 100 I N2 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 8 第二章 共聚焦 开关机 操作指南 （ 1） Ti-E 电动倒置荧光显微镜； （ 2） A1 共聚焦显微镜总控制器； （ 3） A1 共聚焦显微镜 光谱探测模块
10、（ 4） A1 共聚焦显微镜标准 4 通道探测模块； （ 5） A1 共聚焦显微镜扫描头； （ 6） A1 共聚焦显微镜 4 激光台； （ 7） A1 共聚焦显微镜激光器电源柜； （ 8） A1 共聚焦显微镜透射光探测器； 注意：开机时，必须是先打开硬件（包括显微镜，激光器，共聚焦总控制器），再打开 NIS-Elements软件；关机时，必须是先关掉软件，再关掉硬件。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 9 （一） A1R-si 开机顺序 1. 打开 UPS 或接线板总电源开关 （ 一般都处于开机状态 ） ； 2. 打开需要使用的激光器，不使用的激光器可以不打开 （ 具体见后面
11、 ） ； 3. 打开共聚焦控制器左侧面板右上角的控制器开关； 4. 依次打开电脑，显微镜的长寿命汞灯电源，卤素灯电源，电动载物台控制电源； 5. 打开显微镜底座右后端的 HUB 控制部件电源； 6. 待确认控制器打开的状态下，双击桌面 N IS-Elements 3.0 快捷图标，选择 Nikon A1/C1 confocal 选项进入软件，开始共聚焦操作。 （二） A1R-si 关机顺序 1. 请先确认关闭软件，再关闭共聚焦控制器（此条请特别注意） ； 2. 依次关闭显微镜各个控制部件电源； 3. 依次 关闭各个激光器之后 ， 关闭激光器电源总开关； 4. 关掉 UPS 或接线板总开关 （
12、遇到如停电等特殊情况时进行此步骤 ） 。 （三） 激光器的开关 机顺序 各个激光器的开关是独立的。下面分别加以介绍： 首先要打开激光器 电源盒前面钥匙旋钮， 然后根据需要打开相应的激光器。 （ 1） 640nm 激光器电源操作面板 开机：电源开关拨到 ON 位置 -钥匙开关拨到 I 位置 ; 关机：钥匙开关拨到 O 位置 -电源开关拨到 OFF 位置 （ 2） 405nm 激光器电源操作面板 开机：电源开关拨到 ON 位置 -钥匙开关拨到 I 位置 ; 关机：钥匙开关拨到 O 位置 -电源开关拨到 OFF 位置 （ 3） 488nm 多线 Ar 离子激光器 开机： 确认开 关5 处于 Stan
13、dby 位置后 ， 将 钥匙开关6 转到 on 位置，这时风扇开始 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 10 转动 -大约 30 秒后，液晶面板会有数字显示 17 左右 -把左侧开关5 由 standby 拨到 operate，液晶面板显示数值 40 左右，打开完成； 关机：把左侧开关由 run 拨到 standby-3a 上的钥匙开关转到垂直位置 -等几分钟， 待风扇停止转动之后，把电源开关拨到 OFF 位置。 （ 4） 543nm 激光器（开关内置在激光底座电源中） 注意：多线 Ar 离子激光器功率较高，请务必按照操作步骤开关机，否则会造成该激光器 使用寿命的缩短，并有可能
14、导致激光器的损坏。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 1 1 第三章 共聚焦 图像拍摄 （一） NIS-Elements C 软件开启 和操作界面简介 1 1 打开和关闭 Camera Settings 窗口 当 N IS-Elements 启动时， Camera Settings 窗口自动打开；随 着 N IS-Elements 关闭而自动关闭。 1.1.1 启动 Camera Settings 窗口 双击 N IS-Elements 图标。 图 1.1-1 NIS-Elements 图标 硬件首先进行初始化，桌面上出现 Now initializing对话框。硬件初始化结
15、束后，该对话框自动关闭。 图 1.1-2 Now-Initializing 对话框 当硬件初始化结束后，弹出 N IS-Elements 标题窗口；标题窗口自动关闭后， NIS -Elements 启动运行。随即 Camera Settings 自动打开。 该窗口也可以通过 V i e w 菜单下 Acquisition 栏里找到。 图 1.1-3 标题窗口 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 12 图 1.1-4 初始状态的 N IS-Elements 窗口和 Camera Settings 窗口 1.1.2 关闭 Camera Settings 窗口 N IS-Elemen
16、ts 关闭时， Camera Settings 也自动关闭。 1.2 Camera Settings 窗口结构 Camera Settings 是用于设置共聚焦扫描参数的窗体，主要包括：设定激光光源和强度、调整图像亮度、光刺激设定、扫描方法、扫描精度速度等。 图 1.2-1 Camera Settings 窗体 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 13 表 1.2-1 Camera Settings 窗体 功能列表 功能名称 功能描述 （） 图像获取 捕捉实时 (live)图像，拍摄图像或应用光刺激设置。 此类型的功能均以按钮的形式呈现。 （） 扫描模式选择 用于 共振扫描模式
17、 与 检流计式扫描模式 的切换。当处于实时（ live）捕捉状态下时，扫描模式不能更改。 在 光谱探测 （ Spectral Detector）模式和 虚拟滤色片 (Virtual Filter)模式下，只有 检流计式扫描模式 可用，因此不能改变扫描模式。 （） 滤色块和染料 用于设置探测通道系列和光路设定。 （） 图像获取光刺激设定 图像获取 画面用于设定 PMT 亮度、激光功率和 针孔 大小。 光刺激画面中设置用于刺激的激光的功率。 （） 扫描参数设置 选取扫描方法、精度、速度等。 （） 遥控器选择图标 用于标识当前处于遥控器控制下的通道。 1.3 NIS-Elements 的操作界面 （
18、 1）主菜单栏；（ 2）上图标工具栏；（ 3）左图标工具栏；（ 4）窗口排布选择；（ 5）控制窗口边栏； （ 6） 图像 显示区域；（ 7）状态栏 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 14 上图标工具栏和左图标工具栏图标介绍： Open：打开文件 Save：保存当前文件 Save next：将当前文件保存为新文件 Print：打印 Undo：撤销前一步操作 Redo：还原一步撤销的操作 Live Fast：快速预览 Z Stack Live： Z 轴序列预览 Integrate：叠加，多次拍摄图像累积 Average：平均，多次拍摄图像平均RAM Buffer ON：打开内存拍
19、摄 Capture to RAM Buffer：拍摄存至缓存 Backgroud Correction ON：打开背景校正 Optical Configurations：打开光路配置设定 New Optical Configuration：创建光路配置 Pointing Tool：指针按钮 Magnifier Glass：图像放大工具 Annotations & Measurement：注释和测量 Binary Toolbar：二元蒙板编辑工具 Define/Run Experiment：打开多维拍摄窗口 Capture Time Lapse：拍摄时间序列 Capture Z Series：拍
20、摄 Z 轴序列 Capture Multichannel：拍摄多通道 Capture Multipoint：拍摄多点 Copy：复制 Paste As New Image：粘贴复制图像 Crop：剪切 Run Macro：执行宏命令 Close All：关闭全部窗口 General Option：打开设置窗口 Customize Toolbar：自定义工具栏 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 15 控制窗口介绍： N IS-Elements AR 软件所有控制窗口均可以在主菜单栏 V i e w 菜单下找到，或者在 图像 显示区域点击鼠标右键弹出。 Acquisition：
21、AVI Acquisition： A V I 拍摄 Auto Capture Folder：自动拍摄存储文件夹 Camera Settings*：相机设定 Capture FRET Image*：拍摄 F R E T 图像 Filters and Shutters*：滤色块和光闸控制 L a m p *：光源控制 ND Acquisition*：多维 图像 拍摄 Nosepiece*：物镜转盘控制 Microscope Control Pad*：显微镜控制面板 XYZ Navigation*： XYZ 导航 Z Series*： Z 轴序列 Visualization: Binary L a
22、y e r s ：二元蒙板层编辑 Histogram：柱状图 L U T s : L U T s Opened Images：已打开图像 Preview： 预览窗口 Synchronizer：窗口同步器 XY Overview*： XY 预览 Analysis: Annotations and Measurements：注释和测量 Automated Measurement：自动测量 Automated Measurement Results：自动测量结果 Binary Toolbar：二元蒙板编辑工具 Colocalization：共定位分析 EDF Z-Profile*： Z 序列景深扩展
23、 Intensity Profile：光强分析 Object Count*：目标计数 Object Classifier*：目标分类 Pixel Classifier：像素分类 ROI Statistics： ROI 统计 RT Deconvolution*：实时反卷积 Thresholding： 阈值分析 Time Measurement：时间测量 Tacking*：轨迹分析 Volume Measurement：体积测量 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 （二） NIS-Elements C 的 Live 图像获得 基本操作 本章介绍通过 Camera Settings
24、窗体来获取实时（ live）图像的基本方法。 在进行共聚焦拍照前 ,请将 T i 光路设定到 A1 模式 (左端口光路输出 ,滤色块位置空 )。 2.1 获取实时（ live）图像与扫描区域的设定 1 选择扫描模式 选择 共振 Resonant或 检流计式 Galvano扫描方式。（ A1R 系统同时含有此 2 种扫描模式） 图 2.1-1 选择扫描模式 在光谱探测（ Spectral Detector）模式和虚拟滤色片 (Virtual Filter)模式 下，只有检流计式扫描模式可用，因此不能改变扫描模式。 2 设定光路（ Optical path）配置 1） 打开光路配置窗口 点击“滤色
25、片和染料”画面中的 Setting按钮。 关于光路（ Optical path）设置的详细说明，参见探测模式的章节中关于“滤色块和染料”的部分 图 2.1-2 滤色片和染料画面 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 17 - 图 2.1-3 光路 (optical path)配置窗口 2） 选择探测模式（探测器） DU4：标准探测器， SD：光谱探测器， V F ：虚拟滤色片， V A A S ： VAAS（虚拟光 阑系统） （后面 3 种模式在安装了相关硬件时显示） 图 2.1-4 选择探测器 3） 激活自动光路配置 点击自动 Auto按钮 北京大学化学学院中级仪器实验室
26、A1R 操作说明书 - 18 - 图 2.1-5 选取自动模式 4） 为各个通道选择被观察的染料 从下拉列表中为每一个需要使用的通道选择一个染料。选择染料后，系统将自动为该通道选择合适的激光波长和二向色镜。 图 2.1-6 选择荧光染料 5） 选择所要使用的通道 在需要使用的通道对应的复选框上打勾。 图 2.1-7 选择通道 6） 选择是否使用透射探测器 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 19 - 图 2.1-8 选择透射探测器 7） 最后确认光路设置 点击 ok按钮。确认使用 此光路配置，光路设置窗口关闭。 图 2.1-9 确认光路设定 3. 应用扫描设置 通过 扫描设
27、置画面 可以设定扫描参数。具体设置方法参见 后文 ，“扫描设置窗口”。 图 2.1-10 扫描设置画面 4获取实时图像 点击 L i v e 按钮可以捕获实时图像。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 20 - 图 2.1-11 获取实时图像 图 2.1-12 实时图像 5调整实时图像的亮度 可以通过 图像获取画面 来调整各个通道的亮度。参见 下一节探测模式 中关于“图像获取窗口”的部分内容。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 21 - 图 2.1-13 图像获取画面 6设置扫描区域 设定扫描区域，详见第 9 章 “导航窗口 (Navigation w
28、indow)” 。 1） 将实时窗口 (live window)切换成导航窗口，点击 Show Scan Area按钮 图 2.1-14 从 实时窗口 切换成 导航窗口 图 2.1-15 选择扫描设定工具 2） 选择需要使用的扫描区域设置工具。 关于扫描设定工具的详细用法请参见 “关于扫描区域” 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 22 - 2.1-16 设置扫描区域 3） 利用所选择的工具进行扫描区域的设定。 7在所选择的区域中获取实时窗口 1把导航窗口切换回实时窗口，点击 Show Scan Area 图 2.1-17 从 导航窗口切换回实时窗口 2获取所设定扫描区域的
29、实时图像，点击 L i v e 按钮。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 23 - 图 2.1-18 获取实时图像 图 2.1-19 更改扫描区域后的实时图像 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 24 - （三） 图像拍摄 图像获取窗口主要用于显示实时图像，拍摄图像或是运行光刺激条件。 N IS-Elements 中的相应功能在此都用按钮表示。 3 1 图像获取画面中的主要功能 图 3.1-1 图像获取窗口 表 3.1-1 图像获取窗口的功能列表 (表单 1/3) N a m e Function (1) Live 按钮 用于显示活动图像。 活动图像窗
30、口自动打开并显示活动图像。 所谓活动图像就是当前显微镜上观察的实时图像。 (2) XY 按钮 用于拍摄当前活动窗口所对应的正式图像。 当进行拍摄时，会新弹出一个独立于活动图像的窗口。用 xy功能拍摄的图像是对活动图像重新扫描后生成的静态图像。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 25 - 表 3.1-1 图像获取窗口的功能列表 (表单 2/3) N a m e Function (3) XYZ 按钮 打开 Capture Z-Series对话框。用拍摄三维 (X-Y-Z)图像。关于此处的操作请参见 附件一。 图 3.1-2 拍摄 Z-Series 对话框 中的描述。也可以通
31、过下述方法实现 XYZ功能：在主菜单中选 Acquire然后依次选取 Capture Z-Series - Capture Z-Series Automatically. (4) X Y T i m e 按钮 打开 Capture Timelapse 对话框。用于拍摄二维 (X-Y)时间序列图像。关于此处的操作请参见 附件一。 图 3.1-3 拍摄时间序列对话框 中的描述。也可以通过下述方法实现 X Y T i m e功能：在主菜单中选 Acquire 然后依次选取 Capture Timelapse - Capture Automatically. 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操
32、作说明书 - 26 - 表 3.1-1 图像获取窗口的功能列表 (表单 3/3) N a m e Function (5) X Y Z T i m e 按钮 打开 ND Acquisition 对话框。用于拍摄三维 (X-Y-Z)时间序列图像。关于此处的操作请参见 附件一。 图 3.1-4 多维（ ND）拍摄对话框 (6) Photo Activation 按钮 打开 Photo Activation 对 话框。用于设定光刺激观察模式。 根据 Camera Settings窗口设置条件的不同会打开不同的对话框。 普通光刺激模式 同时光刺激模式 （检流计式扫描） （共振扫描） 图 3.1-5 光
33、刺激对话框 也可以通过下述方法实现 Photo Activation功能 : -普通光刺激模式 在主菜单中选 Applications然后依次选取 Define/Run Sequential Stimulation. 同时 光刺激模式 在主菜单中选 Applications然后依次选取 Define/Run Simultaneous Stimulation. 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 27 - ND Acquisition对话框 其中上面表格内 (3)， (4)， （ 5）项还可以通过如下方法打开： -在主菜单中选 Applications然后选 Define/R
34、un Experiment 在弹出的 ND Acquisition对话框中单击标签 (tab)项来选择所要使用的功能。 关于此处的操作请参见 附件一。 图 3.1-6 多维 (ND)拍摄对话 框 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 28 - （四） 探测模式（标准探测器） 设置 本节介绍使用标准探测器模式的设置 在 标准探测器 模式下可以通过 Optical Configuration对话框对每一个单独的配置项进行管理。 “N IS-Elements C”允许用户保存和提取如下设置：用于图像采集的激光输出，透射探测器的偏移量 (offset),PMT offset,通道选择
35、， 针孔 大小，光刺激用激光选择以及平均模式 (Averages)。 关于如何保存和提取 Optical Configuration设置，请参见“ N IS-Elements Advanced Research Users Guide ”中相关的内容。 4 1 滤块和染料（ Filter and Dye）窗口 本画面用于选择通道和光路配制。 4.1.1 Filter and Dye 窗口的构成 图 4.1-1 Filter and Dye 窗口（用于标准探测器） 表 4.1-1 Filter and Dye 窗口功能列表（用于标准探测器） N a m e Function (1) 探测器 提示
36、当前所选探测模式 (2) 通道交替 选择是同时打开所有用于扫描的激光，还是顺序地一次打 开一个激光器（用于防串色） (3) Setting 按钮 打开 Optical path窗口， 用于选择探测器，二向色镜，探测通道以及每个通道所对应的荧光染料，激光等 (4) 状态 提示各个通道的设置情况 (染料名称，激光波长以及探测波长带宽 ). (5) TD 提示透射探测器状态处于使用中 (“ON“) 或是未使用 (“OFF“). 4.1.2 设置光路 (Optical Path) 点击 Filter and Dye窗口中的“ Setting”按钮，显示 Optical Path 窗口。选择标准探测器 (Standard Detector(DU4) 光路设置分为自动 Auto和手动 Manual两种模式，通常可以使用自动模式。 北京大学化学学院中级仪器实验室 A1R 操作说明书 - 29 - 图 4.1-2 Filter and Dye 窗口 图 4.1-3 Optical path 窗口（自动模式）
