1、 CRISPR Cas9 基因敲除试剂盒 产品说明书 本说明书适用于以下产品： 货号 货号 CRISPR/Cas9 试剂盒 CR0001 CRISPR/Cas9Nick 试剂盒 CR0002 pCas9/gRNA1 载体 CR1001 pCas9/gRNA3 载体 CR1004 pTYNE 验证载体 CR1011 V2.0 北京英茂盛业生物科技有限公司 北京市昌平区沙河镇青年创业大厦 B916 Tel： 01062495135 Emai： Web site： http:/ 产品说明书 1 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 产品内容 Cas9 基
2、因敲除试剂盒 货号 CR0001 内容 包装 pCas9/gRNA1 载体 3ug in TE Buffer pTYNE 验证载体 3ug in TE Buffer pCas9P 阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9N 阴性对照载体 3ug in TE Buffer Cas9Nicknase 基因敲除试剂盒 货号 CR0002 内容 包装 pCas9/gRNA3 载体 3ug in TE Buffer pTYNE 验证载体 3ug in TE Buffer pCas9Pf 阳性对照载体 3ug in TE Buffer pCas9Pr 阳性对照载体 3ug in TE B
3、uffer pCas9/gRNA1 载体 货号 CR1001 内容 包装 pCas9/gRNA1 载体 3ug in TE Buffer pCas9/gRNA3 载体 货号 CR1004 内容 包装 pCas9/gRNA3 载体 3ug in TE Buffer pTYNE 验证载体 货号 CR1011 内容 包装 pTYNE 验证载体 3ug in TE Buffer 保存条件： 20冻存 所需其他材料 EcoRV 限制性内切酶。 T4 DNA ligase。 dH5a、 Top10 或其他常用感受态细胞。 细胞培养基及其他细胞培养相关试剂。 HEK293T 细胞或 293V 细胞（ 货号
4、C1201） 。 转染试剂（ PolyfectV 货号 P20101） 。 产品说明书 2 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: CRISPR Cas9 基因敲除原理 CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在该机制中， Cas 蛋白（ CRISPassociated protein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条 DNA 链。一旦与 crRNA（ CRISPR RNA）和 tr
5、acrRNA 结合形成复合物， Cas 蛋白中的核酸酶即可对与复合物结合的 DNA 进行切割。切割后 DNA 双链断裂从而使入侵的外源 DNA 降解。 1、 Cas9 蛋白 来自 Streptococcus pyogenes 的 Cas9 由于 PAM 识别序列仅为 2 个碱基（ GG） ，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点， 因此得到广泛的应用。 Cas9 蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性， 包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。识别 RNA（ gRNA）可以通过载体表达或者化学合成后与 Cas9 蛋白共同进入细胞，对特异 DNA 序列剪切，从而促使 DNA 发生 NHE
6、J ( nonhomologous endjoining)导致的基因缺失或同源重组，实现基因敲除。 Cas9 对 DNA 切割示意图： 2、 Cas9Nicknase 蛋白 Cas9Nicknase 是 Cas9 蛋白的 D10A 突变体，切割 DNA 单链。由于 DNA 上的 Nick 缺口会很快被细胞修复，一般不会造成基因突变。 Cas9Nicknase 需要成对的 gRNA 辅助才能实现 DNA 双链断裂。 采用 Nicknase 蛋白可以提高基因敲除的特异性，但是对 gRNA 的设计要求较高。敲除效率也比 Cas9 蛋白低一些。 简单地说， Cas9 基因敲除效率更高，操作更容易； C
7、as9Nicknase 特异性更高。您可以根据实验设计需要进行选择。 Cas9Nicknase 对 DNA 切割示意图： 北京英茂盛 业www.inovogenTel: 01062495Email: orderi用 pCas9pCas9/g挑 选业 生物科技有 限.com 135 /gRNA1RNA载 体转染目 的选 转染阳 性限 公司 或 pCas9构构在pT Y体 与筛选 载的 细胞性 细胞， 检果/gRNA3设计基 因构 建pCas 9构 建pTY NNE载 体载 体共检 测敲除 效3 载体进 行因 敲除靶 点/gRNA载E验证 载体 上进行 靶效pCa行 基因敲 除点载 体载 体靶
8、点验证s9/gRNA转 染挑选转 染除 流程 载体与 重染 目的细 胞染 阳性细 胞果产 品重 组载体 共胞胞 ，检测 敲果本试剂盒中包含内容 品 说明书 共敲 除效产品说明书 4 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 操作说明 CRISPR/Cas9 基因敲除载体构建 引物列表： 引物名称 序列（ 5 3 ） 用途 gRNAF GACTATCATATGCTTACCGTAACT pCas9/gRNA1、 pCas9/gRNA3 载体鉴定和测序 gRNAR CAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA pCas9/gRNA1、 pCas9/gRNA
9、3 载体鉴定 所需试剂： EcoRV 核酸内切酶； T4 DNA 连接酶； dH5a、 Top10 或其他常用感受态细胞； DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒。 pCas9/gRNA1 载体 pCas9/gRNA1 载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化 Cas9 蛋白和 gRNA，只需转染一个质粒就能实现对靶基因的切割。 产品说明书 5 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: pCas9/gRNA3 载体 pCas9/gRNA3 载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化 Cas9Nickase 蛋白和 gRNA。 载体原件说明： CMV promoter：最广泛
10、使用的真核细胞启动子之一，在绝大多数哺乳动物细胞中高效表达。 Cas9/Cas9Nick：人源化的 Cas9 蛋白或 Cas9Nicknase 蛋白，实现 DNA 切割功能。 BGH pA： BGH polyA 信号。 U6 promoter： U6 启动子属于 III 类 RNA 启动子，有精确地转录起始位点和终止位点，可以准确的转录出gRNA，并且在各种动物细胞中都表达良好。 gRNA：识别基因敲除靶点。 简要 步骤 1、设计合成寡核苷酸链。 2、将寡核苷酸链退火为双链。 3、 EcoRV 酶切线性化 pCas9/gRNA1 载体。 4、寡核酸链与 pCas9/gRNA1 载体连接并转化感
11、受态细胞。 5、 PCR 鉴定阳性克隆并测序。 注： 对于实验中的很多步骤，您可以使用您实验室中常用的方法，或者您的实验经验证实有效的方法。对于酶切、 DNA 纯化以及转化等步骤，您可以参照分子克隆实验指南进行，也可以参照您购买的试剂盒中生产商提供的使用说明进行。 产品说明书 6 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 1 基因敲除靶点和寡核苷酸设计 1.1 基因靶点选择 CRISPR/Cas9 基因敲除系统的靶点由 19 个碱基构成。靶点前面为转录起始信号 G。靶点后面为 PAM 序列NGG。在设计基因敲除时，在基因的起始密码子附近及下游查找 GN2
12、0GG 序列作为靶点。如果没有合适的序列，也可以选择 N20GG 的序列，构建载体时人工加上一个 G 作为启动信号。 推荐使用 Zhang Lab 的在线设计软件进行设计： http:/crispr.mit.edu/。 以人的 MET 基因 (GeneID: 4233)为例，可选的靶点如下： Start Codon 靶点 1 ATAAACCTCTCATAATGAAGGCCCCCGCTGTGCTTGCACCTGGCATCCTCGTGCTCCTGTTTACCTTGGTGCAGAGGAGC 靶点 2 AATGGGGAGTGTAAAGAGGCACTAGCAAAGTCCGAGATGAATGTGAATAT
13、GAAGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGCGGAAACACCCATCCAGAATGTCATTCTACATGAGCATCACATTTTCCTTGGTGCCACTAACTACATTTATGTTTTAAATGAGGAAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGC 靶点挑选要点： 1） ： Cas9/gRNA 基因敲除原理是对基因组 DNA 序列切割后引发 DAN 修复，产生 DNA 序列缺失突变。因此基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。 2） ：现有的研究显示不同 Cas9/gRNA 靶点在基因敲除效率上有较大差异
14、，但对其原因尚不清楚。因此同时设计构建 23 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点是必要的。 3） ：现在的研究表明靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 712 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较小。而碱基错配的影响在不同靶序列中差别很大，有的靶序列特异性较高而有的较差。将设计好的靶点序列在基因库中进行 BLAST 检测是必要的。同时多设计构建 23 个靶点并且在检测敲除效率的同时检测非特异性切割也有助于获得理想的基因敲除效果。 4） Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。我们一般在正义链和反义链上分别挑选相距 2030bp 的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有
15、较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。 1.2 插入片段设计 干扰靶点序列通过 EcoRV 位点插入 pCas9/gRNA1 或 pCas9/gRNA3 载体中。 插入完成后完整的 gRNA 表达框序列如下： U6 promoter TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACA
16、CAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTA gRNA-F primer TGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGA 产品说明书 7 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: Targeting sequence gRNA sequence gRNA-R primer AAGGACGATACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAG
17、AGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT 插入前的 gRNA 表达框序列如下： U6 promoter TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAG
18、TAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTA gRNA-F primer TGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGA EcoRV AAGGACGATATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT 插入寡核苷酸序列设计： 正向序列 5ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3 反向序列 3TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNN
19、NNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5 设计时将 19nt 的基因敲除靶点序列替换上面序列中的 N 即可。 以前面 MET 基因的靶点 1 为例，设计插入寡核苷酸序列方法如下： 1、 基因敲除 19nt 靶序列为： CCCCCGCTGTGCTTGCACC。 2、 需合成的正向寡核苷酸序列为： 5ACACCGCCCCCGCTGTGCTTGCACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3 3、 根据正向寡核苷酸序列生成反向互补序列，即为反向寡核苷酸序列： 5AACGGACTAGCCTTATT
20、TTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGGTGCAAGCACAGCGGGGGCGGTGT3 合成寡核苷酸注意事项： a） ：合成的寡核苷酸质量对于能否成功构建载体至关重要。请务必委托值得信赖的公司进行合成。 b） ：必须 PAGE 纯化寡核苷酸。 产品说明书 8 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 2 pCas9/gRNA 基因敲除载体连接和鉴定 2.1 寡核苷酸退火 用水将寡核苷酸稀释为 100 M。按以下体系配制退火反应体系： 正义寡核苷酸（ 100 M） 5l 反义寡核苷酸（ 100 M） 5l NaCl 100 mM（终浓度
21、） TrisCl pH7.4 50mM（终浓度） 加水补足 50l 将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置 PCR 仪上，运行以下程序： 90 4min， 70 10min， 55 10min， 40 10min， 25 10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在 20长期保存。 2.2 酶切线性化载体 用 EcoRV 酶切 2g pCas9/gRNA 载体。酶切方法和体系参照您购买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。 通常情况下用大约 2030 单位的酶大约 3 小时可以酶切完全。 酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量，通常线性化载体的
22、工作浓度为 50100ng/l。 注意事项： 1) 在后面的连接体系中， 我们使用的载体浓度为 50100ng/ul。 如果您回收后的载体浓度不在该范围，请调整连接体系中的载体体积，确保载体用量和推荐用量一致。 2) EcoRV 酶切后的载体为平末端，有可能发生载体自连。对回收的线性化载体进行去磷酸化处理可以减少载体自连发生。但载体去磷酸化也会降低连接效率，我们一般不推荐进行去磷酸化处理。 2.3 连接 用水将退火后双链寡核苷酸 (10M)稀释 100 倍 备用。 按照以下体系配制连接反应体系： T4 DNA 连接酶 5U EcoRV 5U 线性化载体 2l 稀释 100 倍后双链寡核苷酸 1
23、l 10连接酶 Buffer 1l 50%PEG4000 1l 加水补足 10l 反应条件： 22 30min， 37 15min。 注： 1) 平末端连接效率较低，在连接体系中添加 PEG4000 可以提高连接效率。 产品说明书 9 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 2) 在连接体系中添加 EcoRV 酶可以显著提高阳性率。 2.4 转化感受态细胞及 PCR 鉴定阳性克隆 用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。市场上常见的大肠杆菌感受态细胞（例如 Top10， DH5）均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制备感受态细胞。转化方法按照供应商
24、的说明书或者您实验室中常用的方法进行。 在氨苄抗性的琼脂平板上 37培养转化后细菌，大约 1416 小时后，平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行鉴定。 鉴定方法可以采用 PCR 鉴定。 克隆 PCR 鉴定： 鉴定引物： gRNAF GACTATCATATGCTTACCGTAACT gRNAR CAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA 阳性克隆鉴定产物大小为 190bp，阴性克隆无条带。鉴定的阳性克隆用引物 gRNAF 测序。 构建好的 pCas9/gRNA 载体可以转染细胞，进行基因敲除。也可以先用 pTYNE 载体验证构建好的pCas9/gRNA 载体切
25、割 DNA 效率，再在目的细胞上进行基因敲除实验。 产品说明书 10 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 3 基因敲除验证载体 pTYNE 构建 为了方便验证基因敲除靶点的效率及特异性，我们设计了验证载体 pTYNE。该载体中含有起始密码子移位突变，在未发生 DNA 剪切和突变时不能有效表达 EGFP 蛋白，不出现荧光。当 pCas9/gRNA1 载体表达出的 Cas9/gRNA 复合物实现对 pTYNE 质粒的切割后， DNA 断裂引发的 NHEJ 作用即可实现对 EGFP 蛋白的修复，从而产生荧光。通过荧光细胞数量多少，可以反映基因敲除效率的高
26、低。 pTYNE 载体也可以用于 TALEN 或 ZNF 基因敲除载体的验证。 原理示意图： Cas9/gRNA 复合物修复 pTYNE 载体上的 GFP 基因 产品说明书 11 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 3.1 基因敲除靶点克隆到 pTYNE 载体 pTYNE 载体多克隆位点序列： .CMV promoter .GCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC SacI PstI KpnI NheI Start codon XhoI HindII
27、I EcoRI SalI CGCTAGCCGAAGATGCCACCATGGGCCACCATGGCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCG ApaI BamHI SacII SmaI NotI CGGGCCCGGGATCCTAGGGATAACAGGGTAATAGAAGCGGTGGGTCTGGCGGCGGAGGATCTGCGGCCGCAT EGFP coding sequence GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC
28、GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC. pTYNE 验证载体构建设计方法： 1、 将含有基因敲除靶点的序列通过载体上的酶切位点插入到 pTYNE 载体中。 2、 插入序列中可以含有或者不含启动密码子 ATG。当插入序列中有 ATG 时，应仔细核对 EGFP 基因的读码框， 避免插入序列中的 ATG 与 EGFP 基因的读码框一致， 从而不能实现 pTYNE
29、 载体的验证功能。 3、 一般插入含有基因敲除靶点的几十个碱基对的序列即可对基因敲除效率进行验证， 也可以是包含几个敲除靶点的 100200bp 序列。插入序列可以基因合成或者 PCR 扩增获得。 4、 载体的酶切和连接方法与一般的载体构建无异，请按照您的实验室常规操作方法进行即可。 3.2 pTYNE 载体阳性克隆 PCR 鉴定 鉴定引物： TYF TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG TYR CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 阴性克隆 PCR 产物大小： 254bp。阳性克隆 PCR 产物大小： 254bp+插入序列大小。 测序引物： TYF。 产品说明书 12 北京英
30、茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 4 用 pTYNE 载体和对照载体进行效率检测实验 4.1 检测 pCas9/gRNA1 载体基因敲除效果 pCas9/gRNA1 载体基因敲除的效果可以通过对靶点的测序或者 T7 内切酶进行检测。也可以用 pTYNE 载体进行直观的检测。 我们用 293T 细胞为例，检测 pCas9/gRNA1 阳性对照载体的基因敲除效果。 pCas9/gRNA1 阳性对照载体（ pCas9P）靶序列： CTTCGAATTCTGCAGTCGA。该靶点位于 pTYNE EGFP 基因上游。 pCas9/gRNA1 阴性对照载体（ pC
31、as9N）靶序列： ATCGACTAGCCACTCAGAC。该序列为随机序列。 靶点在 pTYNE 载体上的位置 .CMV promoter .GCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC pCas9P 靶点 CGCTAGCCGAAGATGCCACCATGGGCCACCATGGCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCG CGGGCCCGGGATCCTAGGGATAACAGGGTAATAGAAGCGGTGGGTCTGGCGGCGGAGGATCTGCGGCCGCAT
32、EGFP coding sequence GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC. 1、实验材料 pTYNE 质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号： CR1011） pCa
33、s9 N 质粒（ pCas9/gRNA1 阴性对照，货号： CR1003，无内毒素试剂盒制备） pCas9 P 质粒（ pCas9/gRNA1 阳性对照，货号： CR1002，无内毒素试剂盒制备） PolyfectV 转染试剂（货号： P20101） 293T 细胞系 2、实验步骤： 1) 转染前 24 小时将 293T 铺到 24 孔板中。同时准备 2 个孔。 2) 按照下列体系制备 2 个质粒稀释液 组 A 组 B pTYNE 0.4ug pTYNE 0.4ug pCas9 N 0.4ug pCas9 P 0.4ug DMEM 培养基 X ul DMEM 培养基 X ul 总体积 50ul
34、 总体积 50ul 3) 准备转染试剂稀释液： PolyfectV 转染试剂 3.2ul DMEM 培养基 96.8ul 4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。 取 50ul 转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育 15min。 产品说明书 13 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 5) 将转染液加入 293T 细胞。 6) 48 小时后检测 EGFP 荧光表达。 pTYNE+ pCas9 N pTYNE+ pCas9 P 4.2 检测 pCas9/gRNA3 载体基因敲除效果 pCas9/gRNA3 载体需要成对发挥作用
35、。我们根据 TYNE 载体设计构建了 pCas9/gRNA3 阳性对照载体pCAS9Pf、 pCas9Pr。由于 Cas9Nicknase 对一个靶点切割后形成的 DNA 单链断裂会被修复，几乎不会引起 DNA 序列改变。我们用 pCAS9Pf 与 pTYNE 共转染作为阴性对照组， pCAS9Pf、 pCas9Pr 与 pTYNE 三个质粒共转染作为阳性对照组。 pCas9/gRNA3 阳性对照载体 1（ pCas9Pf）靶序列： CGAAGCTTGAGCTCGAGCCA。该靶点位于 pTYNE EGFP基因上游。 pCas9/gRNA3 阳性对照载体 2（ pCas9Pr）靶序列： TAC
36、CGCGGGCCCGGGATCCT。该靶点位于 pTYNE EGFP基因上游。 .CMV promoter .GCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC .CGTTTACCCGCCATCCGCACATGCCACCCTCCAGATATATTCGTCTCGACCAAATCACTTGGCAGTCTAG CGCTAGCCGAAGATGCCACCATGGGCCACCATGGCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCG GCGATCGGCTTCTACGGTGGTACCCGGT
37、GGTACCGAGCTCGAGTTCGAAGCTTAAGACGTCAGCTGCCATGGC Pr 靶点 CGGGCCCGGGATCCTAGGGATAACAGGGTAATAGAAGCGGTGGGTCTGGCGGCGGAGGATCTGCGGCCGCAT GCCCGGGCCCTAGGATCCCTATTGTCCCATTATCTTCGCCACCCAGACCGCCGCCTCCTAGACGCCGGCGTA Pf 靶点 EGFP coding sequence GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC
38、 GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC. 1、实验材料 pTYNE 质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号： CR1011） pCas9 Pf 质粒、 pCas9 Pr 质粒（ pCas9/gRNA3 阴性对照，货号： CR1012，无内毒素试剂盒制备） PolyfectV 转染试剂（货号： P20101） 产品说明书 1
39、4 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 293T 细胞系 2、实验步骤： 1) 转染前 24 小时将 293T 铺到 24 孔板中。同时准备 2 个孔。 2) 按照下列体系制备 2 个质粒稀释液 组 A 组 B pTYNE 0.4ug pTYNE 0.4ug pCas9 Pf 0.4ug pCas9 Pf 0.2ug pCas9 Pr0.2ug DMEM 培养基 X ul DMEM 培养基 X ul 总体积 50ul 总体积 50ul 3) 准备转染试剂稀释液： PolyfectV 转染试剂 3.2ul DMEM 培养基 96.8ul 4) 将质粒
40、稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。 取 50ul 转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育 15min。 5) 将转染液加入 293T 细胞。 6) 48 小时后检测 EGFP 荧光表达。 pTYNE+ pCas9 Pf pTYNE+ pCas9 Pf+ pCas9 Pr 产品说明书 15 北京英茂盛业生物科技有限公司 Tel: 01062495135 Email: 5 问题指南 pCas9/gRNA 载体构建问题 转化后克隆很少或没有 1、 合成引物质量差。解决方法：重新合成引物。 2、 退火不成功。解决方法：严格按照说明书退火。 3、 纯化后载体浓度过低。解决方法：重新
41、酶切纯化载体，连接前对载体定量。 4、 连接效率低。解决方法：设立阳性对照组，排除连接体系中酶、 Buffer 及其它成分的问题。 5、 转化效率低。解决方法：设立阳性对照组，检测转化效率，必要时更换感受态细胞。 转化后克隆很多但没有阳性克隆 1、 载体酶切线性化不完全。解决方法：重新酶切载体，琼脂糖凝胶回收酶切载体。 2、 载体自连过多。解决方法：降低连接体系中的载体用量； 用磷酸酶对载体进行去磷酸化处理。 测序没有正确的克隆 1、 合成引物质量差。解决方法：重新合成引物。 pTYNE 载体验证问题 构建的 pTYNE 载体转染后有荧光 1、 构建的 pTYNE 载体在 EGFP 基因上游有匹配的启动密码子。解决方法：重新设计插入片段，确保 ATG 与 EGFP 基因的读码框不一致。 pTYNE+ pCas9P 共转染组无荧光 1、 转染效率低。解决方法：设立阳性对照组确定转染效率。 重新提取转染质粒或更换转染试剂。 构建好的 pTYNE+ pCas9/gRNA共转染组无荧光 1、 基因敲除效率低。解决方法：重新设计敲除靶点。 2、 pTYNE 构建有误，重新测序，检测 pTYNE 载体中是否包含靶点序列。
